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      米諾環(huán)素對脂多糖誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷的抑制作用

      2021-01-22 02:28:58吳偉斌林欣雨祝春燕
      中國藥理學與毒理學雜志 2020年9期
      關(guān)鍵詞:米諾環(huán)素微血管

      羅 超,吳偉斌,林欣雨,祝春燕

      (紹興文理學院1.元培學院,3.附屬醫(yī)院,浙江 紹興 312000;2.肇慶醫(yī)學高等??茖W校,廣東 肇慶 526020)

      急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一類臨床高發(fā)病率、高死亡率的肺部炎癥性疾病,其發(fā)病與過度炎癥反應、敗血癥、氣體交換受損、肺泡毛細血管屏障破壞和肺水腫等密切相關(guān)[1-2]。研究表明,ALI的發(fā)病機制主要為活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的積累以及過度的氧化應激和炎癥反應,其分子機制可能與炎癥信號的激活有關(guān),如絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶和NF-κB信號通路等[3-4]。肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMEC)是肺氣血交換的物質(zhì)基礎,也是肺部最早受到炎癥攻擊的效應細胞[5]。炎癥刺激一方面增加PMEC細胞壁的通透性,引起肺部蛋白滲出及水腫;另一方面,炎癥損傷的血管內(nèi)皮細胞大量分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、IL-8和細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)等炎癥細胞因子,進一步攻擊肺組織并誘導大量中性粒細胞的聚集,導致肺組織的氧化損傷和炎癥反應,促進肺損傷的發(fā)展[6-7]。

      多聚(ADP-核糖)聚合酶-1〔poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1〕對炎癥反應具有直接促進作用,參與NF-κB等多種炎癥信號傳導通路的調(diào)控,促進多種炎癥因子的表達和釋放[8],在腦膜炎、結(jié)腸炎、腎炎、關(guān)節(jié)炎和慢性阻塞性肺疾病等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用[9]。米諾環(huán)素(minocycline)是一種半合成的第二代四環(huán)素類抗生素,臨床上被廣泛用于治療各種感染性及炎癥疾病,在各類支氣管肺炎、細菌性肺炎等治療中也有應用。近年來,多項研究顯示,米諾環(huán)素具有明顯的PARP-1抑制作用,如米諾環(huán)素可通過抑制PARP-1而保護缺血再灌注心肌細胞的炎癥損傷[10-11]。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞為炎癥模型,研究其通過調(diào)控PARP-1通路對ALI發(fā)病過程中肺微血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷的抑制作用,并探討其抗炎作用機制。

      1 材料與方法

      1.1 藥物、試劑和儀器

      米諾環(huán)素,大連美侖生物技術(shù)有限公司。M131培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺和微血管細胞生長因子(microvascular growth supplement,MVGS),美國Gibco公司;LPS,美國Sigma公司;CCK-8檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒,上海碧云天生物;TNF-α、IL-6、IL-8和ICAM-1 ELISA檢測試劑盒,深圳達科為生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光液,杭州弗德生物;兔抗人PARP-1、磷酸化P65(phosphoralated p65,p-P65)、磷酸化IκB激酶β(phosphorilated IκB kinase β,p-IKKβ)和磷 酸化抑制蛋白 κB(phosphorilated inhibitor of κB,p-IκBα)多克隆抗體購于美國Affinity Biosciences公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體,美國Jackson Immuno Research公司。生物倒置顯微鏡,日本Olympus公司;CO2細胞培養(yǎng)箱和多功能酶標儀,美國Thermo Scientific公司;電泳儀及轉(zhuǎn)移裝置,美國Bio-Rad公司;流式細胞儀,美國Beckman公司。

      1.2 細胞和分組

      人PMEC(HPMEC-ST1.6R)[12],德國美因茲大學病理研究所,培養(yǎng)于含20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L-1和5% MVGS的M131培養(yǎng)基,置5% CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換液1次,待細胞生長至70%~80%融合度后進行傳代,4~6 d傳代1次。

      據(jù)文獻和預實驗結(jié)果[13-14],將實驗細胞分為4組,即細胞對照組、LPS組(LPS 10 mg·L-1作用24 h),LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組(米諾環(huán)素和LPS 10 mg·L-1同時加入,作用24 h)。

      1.3 CCK-8法檢測細胞存活率

      調(diào)整細胞密度為1×108L-1,加入96孔板內(nèi),每孔100 μL,置 37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后按1.2分組加藥處理;作用24 h后,每孔加入CCK-8試劑20 μL,置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育;4 h后用酶標儀于450 nm測定吸光度(A450nm)值,計算細胞存活率。存活率(%)=(加藥組A450nm-空白A450nm)/(細胞對照組A450nm-空白A450nm)×100%。

      1.4 ELISA檢測炎癥因子水平

      調(diào)整細胞密度為1×108L-1,加入96孔板內(nèi),每孔100 μL,置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,按1.2分組加藥處理,作用24 h,收集細胞上清液,采用ELISA測定細胞培養(yǎng)液中TNE-α,IL-6,IL-8和ICAM-1水平。按試劑盒說明操作,酶標儀測定A450nm值,根據(jù)標準曲線計算炎癥因子濃度。

      1.5 流式細胞儀檢測ROS水平

      每孔1×106細胞接種6孔板,按1.2分組加藥處理24 h后,細胞收集后懸浮于終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA中,37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,孵育完畢后用不含血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次,流式細胞儀檢測,以DCF熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平。

      1.6 Western印跡法檢測PARP-1,p-P65,p-IKK β和p-I κB α蛋白表達水平

      每孔1×106細胞接種12孔板,按1.2分組加藥處理24 h后,收集各組細胞,用RIPA裂解液裂解細胞,離心取上清,以BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度,然后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,兔抗人PARP-1,p-P65,p-IKKβ和p-IκBα多抗(1∶1000)4℃孵育過夜;洗膜后,室溫下加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000)孵育1 h,最后通過ECL化學發(fā)光法顯影成像,利用Image J軟件進行蛋白相對積分吸光度分析,以β肌動蛋白為內(nèi)參,以目標蛋白與β肌動蛋白積分吸光度值比值表示PARP-1,p-P65,p-IKKβ和p-IκBα蛋白相對表達水平。

      1.7 統(tǒng)計學分析

      2 結(jié)果

      2.1 米諾環(huán)素對LPS誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞存活率的影響

      CCK-8實驗結(jié)果(圖1)顯示,與細胞對照組相比,LPS組細胞存活率顯著降低(P<0.01);與LPS組相比,LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞存活率顯著升高(P<0.01)。

      2.2 米諾環(huán)素對LPS誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞TNE- α,IL-6,IL-8和ICAM-1釋放的影響

      如圖2所示,LPS 10 mg·L-1損傷使PMEC出現(xiàn)明顯的炎癥反應,與細胞對照組相比,細胞培養(yǎng)液中TNE-α,IL-6,IL-8和ICAM-1含量顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞培養(yǎng)液中TNE-α,IL-6,IL-8和ICAM-1含量顯著降低(P<0.01),提示米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1對LPS誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷有保護作用。

      Fig.1 Effect of minocycIine on ceII viabiIity of human puImonary microvascuIar endotheIiaI ceIIs(hPMECs).Cells were protected by minocycline 10 and 25 μmol·L-1and treated with LPS 10 mg·L-1for 24 h.±s,n=5.**P<0.01,compared with cell control group;##P<0.01,compared with LPS group.

      Fig.2 Effect of minocycIine on tumor necrosis factorα(TNF- α),interIeukin-6(IL-6),IL-8 and interceIIuIar ceII adhesion moIecuIe-1(ICAM-1)reIease in hPMECs induced by LPS.See Fig.1 for cell treatment.±s,n=5.**P<0.01,compared with cell control group;##P<0.01,compared with LPS group.

      2.3 米諾環(huán)素對LPS誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞ROS生成的影響

      流式細胞術(shù)結(jié)果顯示(圖3),與細胞對照組相比,LPS刺激誘導PMEC ROS表達升高(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞ROS水平顯著降低(P<0.05)。

      2.4 米諾環(huán)素對LPS誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞PARP-1,p-P65,p-IKK β和p-I κB α蛋白表達的影響

      Western印跡法結(jié)果顯示(圖4,圖5),與細胞對照組相比,LPS損傷能顯著增加PARP-1蛋白表達(P<0.01),并使NF-κB通路磷酸化激活,p-IKKβ,p-IκBα和p-P65蛋白表達升高(P<0.01)。與LPS組相比,LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組能夠顯著抑制LPS誘導的細胞PARP-1蛋白表達和NF-κB通路激活(P<0.01)。

      Fig.3 Effect of minocycIine on reactive oxygen species(ROS)IeveI in hPMECs induced by LPS.See Fig.1 for cell treatment.±s,n=3.**P<0.01,compared with cell control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with LPS group.

      Fig.4 Effect of minocycIine on protein expression of poIy(ADP-ribose)poIymerase-1(PARP-1)in hPMECs induced by LPS detected by Western bIotting.See Fig.1 for cell treatment.IA:integrated absorbance.±s,n=3.**P<0.01,compared with cell control group;##P<0.01,compared with LPS group.

      Fig.5 Effect of minocycIine on protein expressions of phosphoriIated IκB kinase β (p-IKK β),phosphoriIated inhibitor of kappa B (p-I κB α),and phosphoriIated P65(p-P65)in hPMECs induced by LPS detected by Western bIotting.See Fig.1 for cell treatment.±s,n=3.**P<0.01,compared with cell control group;##P<0.01,compared with LPS group.

      3 討論

      肺部過度炎癥反應是ALI的主要病理機制,PMEC是肺氣血交換的物質(zhì)基礎,也是肺部最早受到炎癥攻擊的效應細胞,失控的炎癥反應導致PMEC損傷凋亡,通透性增加,繼而破壞肺泡-毛細血管屏障,導致大量富含蛋白質(zhì)的液體滲出而引起肺水腫。此外,肺泡-毛細血管屏障的破壞是各類炎癥細胞向肺組織移行、富集的基礎[15-17]??梢?,控制PMEC炎癥損傷,抑制其凋亡和通透性增加,可有效緩解ALI肺水腫的發(fā)生和發(fā)展,并可抑制炎癥細胞向肺組織富集。

      炎癥因子是炎癥發(fā)展過程中的重要介質(zhì),受到炎癥損傷PMEC可分泌大量促炎因子(TNF-α和IL-6等)、趨化因子(IL-8等)和黏附分子(ICAM-1等)。TNF-α和IL-6都是重要的早期炎癥損傷因子,TNF-α是炎癥的重要啟動子,是ALI最先出現(xiàn)的細胞因子,可誘導IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌,促進炎癥反應;IL-6是最強內(nèi)源性炎癥因子,在ALI中,IL-6可直接損傷內(nèi)皮細胞,導致血管通透性增加[5,18]。IL-8和ICAM-1對ALI發(fā)展過程中中性粒細胞的激活及向肺組織聚集具有重要的影響,中性粒細胞的激活、黏附、趨化、遷移和脫顆粒均可導致相應的肺泡功能損傷,并進一步通過釋放多種介質(zhì)加重肺損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示,米諾環(huán)素可抑制LPS誘導的PMEC TNF-α,IL-6,IL-8和ICAM-1等炎癥因子的釋放,緩解細胞炎癥損傷,抑制細胞凋亡,可有效緩解ALI發(fā)病過程中的進一步炎癥級聯(lián)擴大反應,中性粒細胞聚集和肺組織損傷等,對ALI的病情發(fā)展起到延緩和治療作用。許多研究表明,ROS對ALI的發(fā)病機制具有重要的影響,炎癥過程中ROS的增加在ALI全身性炎癥反應的發(fā)展和局部表現(xiàn)中均發(fā)揮了重要作用[21-22]。血管內(nèi)皮細胞的氧化應激與其炎癥損傷和細胞凋亡密切相關(guān),過度表達的ROS一方面破壞了體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡,造成細胞的損傷與凋亡[23];另一方面,細胞的氧化應激又是PARP-1活化的關(guān)鍵因素,繼而進一步激活一系列的炎癥反應[24]。本研究發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對LPS誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞ROS表達具有顯著的抑制作用,可通過對ROS表達的調(diào)控繼而抑制ALI過程中PMEC的氧化應激損傷和PARP-1活化。

      PARP-1與許多調(diào)控炎癥基因表達的轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān),如 NF-κB、NF-AT、活化蛋白-1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1和核呼吸因子-1等[8,25]。NF-κB是第一個被闡述與PARP-1調(diào)控炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB激活也是PARP-1調(diào)控炎癥的中心途徑,活化的PARP-1可激活IKKβ,使其磷酸化生成p-IKKβ,活化的IKK-β 可繼而磷酸化 IκB,使其從NF-κB三聚體(P65/P50/IκBα)上脫落,使得NF-κB由抑制狀態(tài)被激活,NF-κB的P65亞基磷酸化(p-P65)并進入細胞核與DNA上特異性位點結(jié)合,調(diào)節(jié)免疫、炎癥等多種靶基因的表達[26-29]。Western印跡結(jié)果表明,米諾環(huán)素可通過抑制LPS誘導的PMEC PARP-1表達,繼而抑制IKKβ和IκBα的磷酸化激活,最終抑制了P65的磷酸化激活,從而下調(diào)ALI細胞NF-κB信號通路,抑制細胞炎癥損傷和炎癥因子的表達。

      綜上所述,米諾環(huán)素可通過抑制PARP-1的表達,從而抑制IKKβ的磷酸化激活,繼而導致IκB不能磷酸化活化,無法從NF-κB三聚體上脫落,最終抑制NF-κB的活化,從而抑制LPS誘導的PMEC的一系列炎癥反應,有望成為ALI等肺部炎癥性疾病治療的新選擇,其抗炎作用機制及對ALI動物模型的治療作用待深入研究。

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