優(yōu)質秈稻劍葉SPAD值與稻米品質相關性研究

王志東 陳宜波 , 龔蓉 周少川 , 王重榮 李宏 黃道強 周德貴 趙雷 潘陽陽 楊義強 李曉芳

(1廣東省農業(yè)科學院 水稻研究所，廣州 510640；2廣東省水稻育種新技術重點實驗室，廣州 510640; #共同第一作者; *通信聯系人, E-mail:xxs123@163.com)

水稻是我國主要糧食作物，全國60%以上人口以稻米為主食。近年來隨著經濟快速發(fā)展和人們生活水平提高，大家對稻米食味品質要求越來越高。稻米品質主要包括外觀品質、蒸煮食味品質、加工品質和營養(yǎng)衛(wèi)生品質等。大部分消費者都是把稻米蒸煮成米飯后食用，米飯的口感、味道和色澤，即稻米蒸煮食味品質更受關注。目前，大量研究表明稻米直鏈淀粉和蛋白質含量是影響蒸煮食味品質的重要因素[1-8]。稻米蛋白質主要是由抽穗后葉片儲存的蛋白質通過蛋白酶分解成氨基酸經韌皮部運送至籽粒，合成新的蛋白質[9]，籽粒蛋白質含量與葉片蛋白質含量密切相關[10-12]，葉片蛋白質含量與葉片SPAD(Single photon avalanche diodes，葉綠素相對含量)顯著正相關，隨著SPAD值的升高，葉片葉綠素含量和蛋白質含量都呈上升趨勢[13-19]，SPAD值的變化動態(tài)地反映了葉片和籽粒的氮素營養(yǎng)狀況。筆者推測水稻葉片SPAD值與稻米蛋白質含量和食味品質之間也存在著一定的相關性。目前，關于水稻葉片SPAD值與稻米蛋白質含量和食味品質相關性的研究鮮見報導。本研究選擇直鏈淀粉含量中等，在華南地區(qū)具有代表性的優(yōu)質秈稻美香占2號、黃華占和五山絲苗等12個品種(系)作為研究材料，在始穗期、齊穗期、乳熟期、蠟熟期和黃熟期測定劍葉SPAD值，適時收獲，儲藏2個月再測定稻米的各品質性狀。依據劍葉 SPAD值-劍葉氮含量-稻米蛋白質含量-稻米食味品質這一技術路線，通過研究秈稻劍葉SPAD值與稻米品質性狀之間的關系，探究劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量和食味品質之間的相關性，建立預測模型，達到選種或收獲前利用葉片顏色變化預測秈稻食味品質和稻米蛋白質含量的目的，這對今后的優(yōu)質秈稻食味育種和生產具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了降低直鏈淀粉含量差異對食味品質的影響，本研究選擇 12個直鏈淀粉含量中等（16.5%～19.5%），均達到部標2級標準以上而且生育期較一致的穩(wěn)定品種（系）作為試驗材料，分別是美香占 2號、黃華占、五山絲苗、象牙香占、增城絲苗、五廣占、五粵華占、五美占1號、五美占2號、五美占3號、五香絲苗1號和五香絲苗2號。其中，五美占1號、五美占2號和五美占3號是以美香占2號為母本，五廣占為父本雜交并通過系統(tǒng)選育出來的穩(wěn)定品系。五香絲苗1號和五香絲苗2號是以美香占2號為母本五山絲苗為父本雜交并通過系統(tǒng)選育出來的穩(wěn)定品系。

1.2 方法

1.2.1 栽培管理

選取土壤肥力均勻，排灌設施良好的稻田作為試驗用地，采用大田育秧，隨機區(qū)組設計，3次重復。試驗小區(qū)面積為2.33 m×1.17 m，株行距為16.65 cm×16.65 cm，每個小區(qū)種7行，每行14株，共98株。2018年7月21日播種，8月7日插秧，11月15日收獲，栽培管理措施均相同。

1.2.2 葉片SPAD值的測定

用葉綠素分析儀(SPAD)通過測量葉片在兩種波長范圍內（650和940 nm）透光系數來測定SPAD值[20]。本研究采用SPAD-502型葉綠素含量測定儀于10月2日（始穗期）、10月11日（齊穗期）、10月19日（乳熟期）、10月30日（蠟熟期）和11月10日（黃熟期）8：00-10：00測定劍葉SPAD值。具體測定方法如下：在重復Ⅰ中每個材料選取生長均勻開花時期一致的水稻 10株，每株劍葉掛牌標記，然后在不同時期定點測量 10株，測量位置統(tǒng)一為劍葉中間，最后取平均值。

1.2.3 稻米食味值測定

將試驗材料收獲曬干貯藏2個月后，從重復Ⅰ中取樣用小型碾米機把稻谷碾成精米，按米水質量比1∶1.2的比例將精米隔水蒸煮成米飯。采用日本佐竹公司生產的米飯食味計（SATA1B）測定米飯綜合食味值、外觀和口感，重復2次取平均值。

1.2.4 稻米品質性狀測定

稻米收獲曬干貯藏2個月后，從重復Ⅰ中取樣，按農業(yè)農村部部頒標準米質測定方法(NY/T 83-2017)測定糙米率、精米率、堊白度、堊白粒率和透明度；按國家標準稻谷整精米率檢驗方法(GB/T 21719-2008)測定整精米率；按糧油檢驗國家標準稻谷粒型檢驗方法(GB/T 24535-2009)測定粒長和長寬比；按國家標準直鏈淀粉含量測定方法(GB/T 15683-2008)測定稻米直鏈淀粉含量；按食品安全國家標準食品中蛋白質測定方法(GB 5009.5-2016)測定稻米蛋白質含量；按糧油檢驗國家標準大米膠稠度測定方法(GB/T 22294-2008)測定膠稠度。

1.2.5 稻米淀粉黏滯性（RVA）譜特征值測定

淀粉黏滯性（RVA）譜反映的是米粉在加熱-高溫-冷卻過程中在一定剪切力的作用下，淀粉-水體系的黏滯性變化所形成的糊化曲線，是淀粉熱物理特性的反應[21]。本研究中稻米淀粉黏滯特征值按照美國谷物化學協會(AACC)的操作規(guī)程[22]進行測定，測定儀器采用澳大利亞Newport Scientific儀器公司生產的Super-4型快速黏度分析儀（RVA儀），用TCW3（Thermal Cycle for Windows）配套軟件進行數據分析，測定數據包括峰值黏度(peak viscosity)、熱漿黏度(hot past viscosity)和冷膠黏度(cool paste viscosity)。根據這3個基本黏度產生崩解值(Breakdown)、消減值(Setback)和回復值(Consistence)等 3個二級數據。計算公式如下：崩解值=峰值黏度-熱漿黏度，消減值=冷膠黏度-熱漿黏度，回復值=冷膠黏度-熱漿黏度。6個特征值的單位是mPa·s。

1.3 數據分析方法

采用IBM SPSS Stastics 22統(tǒng)計軟件和Excel 2007對數據進行統(tǒng)計分析。

圖1 籽粒發(fā)育過程中12個秈稻品種（系）的劍葉SPAD值Fig. 1. SPAD values of flag leaves of 12 indica rice varieties (lines) during grain development.

2 結果與分析

2.1 秈稻籽粒發(fā)育過程中劍葉SPAD值的變化

為了揭示秈稻葉色在籽粒發(fā)育過程中的變化特征，我們選擇華南地區(qū)具有代表性的優(yōu)質秈稻美香占2號、黃華占和五山絲苗等12個品種（系）為研究材料，在始穗期、齊穗期、乳熟期、蠟熟期和黃熟期測定劍葉的SPAD值。由圖1-A可見，隨著水稻籽粒灌漿的完成，劍葉SPAD值呈逐漸降低的趨勢，從始穗期至蠟熟期，SPAD值降幅差異較小；在黃熟期，SPAD值降至約始穗期的一半；此外，不同品種在不同發(fā)育時期的SPAD值也存在顯著差異，其中五香絲苗1號和美香占2號在始穗期至乳熟期劍葉SPAD值低于絕大部分品種，而在蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值高于大部分品種，五山絲苗在始穗期劍葉SPAD值高于絕大部分品種，而在黃熟期劍葉SPAD值則最低（圖1-A）。進一步分析不同品種在籽粒發(fā)育過程中劍葉SPAD值的變化情況，發(fā)現五山絲苗劍葉SPAD值變異系數顯著高于其他品種，而五美占2號顯著低于其他品種（圖1-B），表明在籽粒發(fā)育過程中，五山絲苗的葉色變化幅度最大，五美占 2號的葉色變化幅度最小，持綠性最好。另外，我們將 12個品種（系）在各個生育時期的 SPAD值進行分析，發(fā)現秈稻劍葉SPAD值在始穗期、齊穗期和乳熟期這三個時期變異系數顯著低于蠟熟期及黃熟期（圖 1-C），表明12個品種（系）在前三個發(fā)育時期葉色差異較小，而隨著籽粒灌漿逐漸完成，葉色差異逐漸顯現，直至黃熟期達到最大。

2.2 秈稻劍葉SPAD值與稻米品質性狀的相關性分析

水稻劍葉是籽粒發(fā)育過程中的重要碳源和碳源輸出場所。前期研究發(fā)現，隨著籽粒灌漿完成，劍葉顏色也隨之發(fā)生顯著變化。為了探究劍葉顏色深淺與稻米品質之間的關系，我們對12個品種（系）的劍葉 SPAD值與稻米品質性狀進行相關性分析。研究結果表明，蠟熟期和黃熟期的劍葉SPAD值均與稻米蛋白質含量呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.77和-0.78，而其他品質性狀，如堿消值、膠稠度、直鏈淀粉含量和脂肪含量均與劍葉SPAD值相關性不顯著（表1）。我們進一步擬合了劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量的線性方程，蠟熟期的回歸方程為y=-0.1116x+10.565，決定系數R2=0.5993（圖2-A）；黃熟期的回歸方程為y=-0.098x+9.217，決定系數R2=0.6028(圖2-B)。以上結果表明通過蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值可以推測秈稻品種的稻米蛋白質含量。

圖2 秈稻蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量的相關性分析Fig. 2. Correlation between SPAD value of flag leaf and protein content of indica rice in waxy ripening stage and yellow ripening stage.

表1 5個生育期劍葉SPAD值與稻米品質性狀的相關系數Table 1. Correlation coefficients between SPAD value of flag leaf and rice quality characters in five growth stages.

2.3 秈稻劍葉SPAD值與稻米淀粉黏滯性譜（RVA）特征值的相關性分析

稻米 RVA譜是評價稻米蒸煮食味品質的重要指標，其特征值包括峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、回復值和消減值。我們對 12個秈稻品種（系）5個生育期的劍葉SPAD值與稻米RVA譜特征值進行相關性分析，發(fā)現蠟熟期劍葉SPAD值與峰值黏度呈極顯著正相關，相關系數為 0.75，與崩解值呈顯著正相關，相關系數為0.69；黃熟期劍葉SPAD值與峰值黏度和崩解值均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.84和0.85（表2）。我們將兩個時期的劍葉SPAD值與峰值黏度和崩解值進行線性擬合，發(fā)現黃熟期與峰值黏度和崩解值的線性關系顯著優(yōu)于蠟熟期，黃熟期決定系數R2分別為0.709和 0.727，顯著高于蠟熟期的決定系數 0.565和0.471（圖3）。已有研究表明，RVA譜特征值中的峰值黏度和崩解值與稻米食味品質呈顯著正相關，食味好的品種普遍表現為峰值黏度及崩解值較高，而食味較差的品種則相反[23-24]。因此，我們對12個秈稻品種（系）的稻米食味值與RVA特征值進行相關分析，發(fā)現峰值黏度和崩解值均與稻米食味值呈極顯著正相關，相關系數分別為 0.76和0.85（表2）。表明隨著峰值黏度和崩解值的上升，稻米食味值逐漸升高，與前人研究結果一致。通過對稻米食味值與RVA特征值相關性分析，以及秈稻劍葉SPAD值與RVA特征值的相關性分析，我們發(fā)現秈稻劍葉SPAD值與稻米食味密切相關。

圖3 秈稻蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米淀粉峰值黏度和崩解值的相關性分析Fig. 3. Correlation analysis between SPAD value of flag leaf and peak viscosity value and breakdown of rice starch in waxy ripening stage and yellow ripening stage of indica rice.

表2 5個生育時期劍葉SPAD值和稻米食味值與稻米淀粉黏滯性（RVA）譜特征值相關系數Table 2. Correlation coefficient between SPAD value of flag leaf, rice taste value and RVA spectrum characteristic value of rice starch in five growth periods.

圖4 秈稻蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值的相關性分析Fig. 4. Correlation analysis between SPAD value of flag leaf and rice taste value in waxy ripening stage and yellow ripening stage of indica rice.

表3 稻米食味品質與劍葉SPAD值和蛋白質含量的相關系數Table 3. Correlation coefficients between rice taste quality and SPAD value and protein content of flag leaf.

2.4 秈稻劍葉SPAD值與稻米食味品質的相關性

為了探究秈稻劍葉SPAD值與稻米食味品質之間的關系，我們對12個品種（系）5個生育時期的劍葉SPAD值與稻米食味值、口感及外觀進行相關性分析，結果發(fā)現蠟熟期和黃熟期的劍葉SPAD值與稻米食味值、口感和外觀均呈極顯著正相關，蠟熟期SPAD值與食味值、口感和外觀相關系數分別為0.77、0.73和0.77，黃熟期SPAD值與這三者的相關系數分別為0.83、0.82和0.81（表3），黃熟期與三者的相關系數均大于蠟熟期。我們進一步將這兩個時期的SPAD值與稻米食味值進行線性擬合，發(fā)現蠟熟期SPAD值擬合的線性關系中的決定系數R2值為0.587，黃熟期的決定系數R2值為0.687（圖4），黃熟期與食味值的相關系數大于蠟熟期。

已有研究表明稻米蛋白質含量與食味品質呈顯著負相關，蛋白質含量越高，米飯食味口感一般越差[1-8]。我們對12個品種（系）的蛋白質含量與稻米食味值進行相關性分析，發(fā)現稻米蛋白質含量與食味品質呈極顯著負相關，相關系數達-0.73（表3），表明隨著蛋白質含量的升高，米飯食味值和口感逐漸下降，與前人的研究一致。前面通過分析劍葉SPAD值與蛋白質含量的相關性，發(fā)現蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量呈顯著負相關（表 1），而稻米蛋白質含量又與稻米食味值呈極顯著負相關（表 3），這在另一角度進一步說明成熟后期劍葉SPAD值與稻米食味呈極顯著正相關，成熟后期葉片不早衰，熟色好，則食味好。以本團隊培育的廣東省主推品種美香占2號和和五山絲苗為列，美香占2號在蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值比五山絲苗高（圖1-A），田間表現持綠性好、轉色順、熟色好，而五山絲苗后期葉片衰黃得快。在生產實踐中美香占2號是特優(yōu)質經濟效益高的品種，曾連續(xù)兩屆獲得全國優(yōu)質稻品種食味品質鑒評會金獎，食味品質明顯優(yōu)于五山絲苗。同樣說明了黃熟期青枝蠟稈，不早衰，熟色好，葉片含氮量較高，轉運至籽粒中的蛋白質較少，則稻米食味好。

3 討論

3.1 秈稻籽粒發(fā)育過程中不同生育時期劍葉SPAD值與稻米品質性狀關系

目前研究秈稻葉片SPAD值與稻米品質關系的研究鮮見報導，前人在玉米和小麥等作物中做了相關性研究。張麗等[25]在玉米中發(fā)現葉片SPAD遞減值與成熟期籽粒蛋白質含量呈顯著負相關，葉片SPAD遞減值可作為判定成熟期籽粒蛋白質含量高低的指標。高飛等[26]研究發(fā)現小麥旗葉SPAD值的遞減速率與籽粒蛋白質含量呈顯著負相關，可以利用旗葉SPAD值遞減速率對籽粒蛋白質含量進行預測；王增裕等[27]發(fā)現小麥葉片含氮量在開花后19～25日這一段時間內的下降幅度與籽粒含氮量百分比呈顯著正相關?？梢娫诟叩戎参镏腥~片SPAD值與籽粒含氮量密切相關。本研究結果表明，秈稻蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量呈極顯著負相關，黃熟期的相關系數比蠟熟期更大，始穗期、齊穗期和乳熟期劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量相關性不顯著。目前，大部分學者認為稻米食味與蛋白質含量呈顯著負相關[1-8]。本研究結果也表明稻米食味值與蛋白質含量呈極顯著負相關。所以通過分析劍葉SPAD值與稻米蛋白質含量相關性和蛋白質含量與食味品質的相關性，說明秈稻成熟后期劍葉SPAD值與稻米食味品質呈顯著正相關。

關于劍葉SPAD值與稻米淀粉譜特征值的關系，目前也鮮有研究報導。本研究通過分析 12個秈稻品種（系）5個生育時期劍葉SPAD值與稻米淀粉譜特征值的相關性，發(fā)現黃熟期劍葉SPAD值與峰值黏度和崩解值均呈極顯著正相關，蠟熟期劍葉SPAD值與峰值黏度和崩解值呈極顯著和顯著正相關。黃熟期與峰值黏度和崩解值相關性均比蠟熟期強。始穗期、齊穗期和乳熟期劍葉SPAD值與稻米RVA譜特征值相關不顯著。前人研究認為RVA 譜特征值中的峰值黏度、崩解值和回復值與稻米蒸煮食味品質呈顯著正相關，主要影響米飯柔軟性和黏度等，能更貼切地反映米飯口感和質地[23-24]，可作為評價稻米食味品質優(yōu)劣的重要指標。本研究結果也表明稻米食味值與峰值黏度和崩解值呈極顯著正相關，與前人研究結果一致。通過分析劍葉SPAD值與淀粉RVA譜特征值的相關性，和淀粉RVA譜特征值與食味品質的相關性，也說明秈稻成熟后期劍葉SPAD值與稻米食味品質呈顯著正相關。

本研究通過直接分析5個生育時期劍葉SPAD值與稻米食味品質關系，發(fā)現當稻米直鏈淀粉含量中等且相近時，秈稻蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值和米飯口感均呈極顯著正相關，同樣是黃熟期相關系數比蠟熟期大。以上結果均表明秈稻成熟后期劍葉SPAD值與稻米食味品質呈顯著正相關。黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值的相關性比蠟熟期更高。而始穗期、齊穗期和乳熟期劍葉SPAD值與稻米品質性狀、淀粉RVA譜特征值和食味品質性狀相關性不顯著。即成熟期劍葉SPAD值越高，葉片持綠性越好，葉片蛋白質含量越高，可能葉片轉移到籽粒中的蛋白質就越少，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越高，稻米食味值就越高。相反，成熟期劍葉SPAD值越低，葉片越黃，籽粒蛋白質含量越高，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越低，稻米食味值越低。

3.2 黃熟期劍葉SPAD值影響稻米食味品質原因探討

本研究結果表明，秈稻黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味品質呈極顯著正相關，成熟時青枝蠟稈，轉色順、熟色好、食味好，相反葉片衰老發(fā)黃，食味差。筆者推測可能是水稻營養(yǎng)生長期隨著葉片顏色加深，葉片中積累的氮素逐漸增加，在灌漿成熟期隨著葉片慢慢衰老，葉片中的氮素逐漸轉移至籽粒中合成蛋白質，后期葉片SPAD值越低，葉片的氮素含量越少，說明葉片向籽粒轉運的氮素越多，使得籽粒當中的蛋白質含量越高。稻米蛋白質含量高，蛋白質可能通過二硫鍵結合形成蛋白質網絡，減少了淀粉水合的有效含水量，協同提高了糊化多相體系的濃度，增強了分散相與黏稠相的相互作用，最后抑制了淀粉的糊化。同時，高蛋白質使得籽粒結構緊密，大量蛋白體填塞在淀粉體間的空隙，導致米粒淀粉糊化時不能充分吸收水分，淀粉不能充分膨脹[28-30]。另一方面蛋白質含量越高，其與淀粉結合越緊密，打破蛋白質網絡使淀粉糊化就需要更多的能量，同樣導致稻米淀粉糊化膨脹受到抑制。當淀粉粒的糊化和膨脹被抑制時，稻米淀粉峰值黏度和崩解值均降低，米飯就表現為黏性小，硬度大，口感食味差，這也解釋了為什么稻米蛋白質含量越高，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越低，米飯食味越差。所以蛋白質不僅是稻米營養(yǎng)品質的重要組成部分，其含量的高低也直接影響稻米的蒸煮食味品質。

當秈稻直鏈淀粉含量中等且相近時，蠟熟期和黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值呈極顯著正相關，與蛋白質含量呈極顯著負相關，黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值和蛋白質含量的相關性比蠟熟期高。利用黃熟期劍葉SPAD值可以預測秈稻食味值，回歸方程為y=0.901x+65.76，決定系數R2=0.687；利用黃熟期劍葉SPAD值可以預測秈稻稻米蛋白質含量，回歸方程為y=-0.098x+9.22，決定系數R2=0.602。本研究通過分析籽粒發(fā)育過程中5個生育時期劍葉SPAD值與稻米品質性狀的相關性，建立了黃熟期劍葉SPAD值與稻米食味值和蛋白質含量之間的相關關系和預測模型。達到在選種或收獲前通過劍葉SPAD值預測水稻食味品質和稻米蛋白質含量的目的，為今后的優(yōu)質秈稻食味育種、高氮白水稻育種和利用葉色監(jiān)測水稻品質技術奠定理論基礎，這在今后的優(yōu)質秈稻食味育種和生產中具有非常重要的意義。但這只是表型性狀的關系，葉片葉綠素含量變化是如何影響葉片和籽粒蛋白質含量積累，進而影響米飯食味的形成機理還需要進一步深入研究。