基于信息熵與響應(yīng)面設(shè)計(jì)的冰硼痔瘡栓提取工藝優(yōu)選

王 玉，李 希，馮建安，黃 嫣，毛 紅，趙 強(qiáng)，施崇精

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中醫(yī)研究所，四川 成都 610031)

痔瘡是我國城市居民常見肛腸科疾病之一，近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，其發(fā)病率逐漸上升[1]，發(fā)病人群分布廣泛，任意年齡段均可發(fā)病，痔瘡的臨床癥狀有肛周疼痛、肛門腫脹、大便滴血、便干或秘結(jié)等[2]，對患者的生活與工作影響極大。冰硼痔瘡栓功能消炎止痛、生肌止血，能夠有效緩解各期痔瘡疼痛和出血，調(diào)節(jié)微循環(huán)，促進(jìn)毛細(xì)血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，臨床療效顯著，且不良反應(yīng)少[1]。

冰硼痔瘡栓由黃連、黃柏、大黃、地榆、苦參、紫草、冰片、硼砂等15味藥材組成，根據(jù)原處方工藝及藥材性質(zhì)，其中5味藥材采用乙醇提取工藝，分別是黃連、黃柏、大黃、地榆、苦參，黃連和黃柏均具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。現(xiàn)代藥理研究表明[3-8]，鹽酸小檗堿是黃連和黃柏抗炎的主要成分，因此，本研究以鹽酸小檗堿含量為主要指標(biāo)并結(jié)合出膏率評價冰硼痔瘡栓的提取工藝。評價提取工藝的關(guān)鍵是工藝設(shè)計(jì)和對各指標(biāo)的賦權(quán)，本研究采用信息熵賦權(quán)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)合[9-10]，優(yōu)選冰硼痔瘡栓提取工藝參數(shù)，從而獲得質(zhì)量穩(wěn)定均一的浸膏，為制劑的后期研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過程報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；Waters 2998 PDA檢測器(Waters公司)；BT-125D分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；BH-15電子天平(啟東友銘衡器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃連飲片、黃柏飲片、大黃飲片、地榆飲片、苦參飲片均購于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所謝守德主任中藥師鑒定為真品，均符合2015年版《中國藥典》有關(guān)規(guī)定；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201814，含量86.7%)，購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為超純水；其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的定量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)；乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)；檢測波長254 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.12 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取各試驗(yàn)項(xiàng)下提取液，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 陰性溶液制備 按處方比例，取缺黃連飲片和黃柏飲片的其余藥材，按供試品溶液制備方法，制備陰性溶液。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 分別取以上對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液，按照上述色譜條件測定，結(jié)果表明，指標(biāo)成分色譜峰分離度好，陰性無干擾。色譜見圖1。

注：A：對照品溶液色譜；B：供試品溶液色譜；C：陰性溶液色譜

2.1.6 線性與范圍試驗(yàn) 分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.112、0.224、0.336、0.448、0.560、1.12 mg/mL的對照品溶液，按照上述色譜條件測定，以濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=40000000X+449157(r=0.999 6)，表明鹽酸小檗堿在0.112～1.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取同一份對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.31%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行測定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為2.53%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.80%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品溶液6份，取鹽酸小檗堿對照品適量，按1∶1的比例加入，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸小檗堿的回收率為98.47%，RSD為3.34%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 干膏得率測定

精密移取提取液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算干膏得率。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn) 以鹽酸小檗堿含量和干膏得率為指標(biāo)，分別考察影響乙醇提取工藝的關(guān)鍵影響因素乙醇濃度、加乙醇量、提取時間、提取次數(shù)，確定響應(yīng)面試驗(yàn)影響因素的水平。

乙醇濃度的影響：按處方比例稱取藥材，分別加入乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液8倍量，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，濾液進(jìn)行含量測定和干膏得率測定(圖2)，確定響應(yīng)面考察乙醇濃度影響因素的范圍為60%～80%。

圖2 乙醇濃度影響因素試驗(yàn)結(jié)果

加乙醇量的影響：按處方比例稱取藥材，分別加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液6、8、10、12倍量，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾液進(jìn)行含量測定和干膏得率測定(圖3)，確定響應(yīng)面考察加乙醇量6～10倍。

圖3 加乙醇量影響因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時間的影響：按處方比例稱取藥材，加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液8倍量，加熱回流提取2次，每次分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，過濾，濾液進(jìn)行含量測定和干膏得率測定(圖4)，確定響應(yīng)面考察提取時間影響因素的范圍為1.0～2.0 h。

圖4 提取時間影響因素試驗(yàn)結(jié)果

提取次數(shù)的影響：按處方比例稱取藥材，加入乙醇濃度為70%的乙醇溶液8倍量，分別加熱回流提取1、2、3次，每次1 h，過濾，濾液進(jìn)行含量測定和干膏得率測定(圖5)。由圖5可知，提取次數(shù)2次為最優(yōu)，因此固定提取次數(shù)2次。

圖5 提取次數(shù)影響因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)冰硼痔瘡栓提取工藝因素水平表，以綜合評分為指標(biāo)[11-12]，由信息熵賦權(quán)得到組合權(quán)重(表1)，按提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)(表2)，方差分析見表3。

表1 提取工藝權(quán)重

表2 提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 提取工藝方差分析結(jié)果

2.3.3 信息熵賦權(quán) 參照文獻(xiàn)[11-16]，首先列出原始評價矩陣(X)；再將其轉(zhuǎn)換成“概率”矩陣(P)，如下。

根據(jù)公式，計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的Hi，如下。

Hi=(0.9952 0.9977)

根據(jù)公式，計(jì)算各評價指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，如下。

Wi=(0.6816 0.3184)

即原始矩陣加權(quán)處理綜合指標(biāo)=X/Xmax×0.06816+Y/Ymax×0.03184。

得到回歸方程為：R=0.99+0.075A+0.03C-0.16A2-0.034B2-0.039C2，r=0.980 3表明模型預(yù)測性良好，由方差分析可知該模型P<0.000 1，說明該模型具有極顯著性。影響因素乙醇濃度P<0.000 1，表明該因素具有極顯著性；影響因素提取時間P>0.05，表明該因素不具有顯著性；影響因素加乙醇量P<0.05，表明該因素具有顯著性。綜合分析可知，影響因素的順序?yàn)椋阂掖紳舛?提取時間>加乙醇量，等高線圖和三維曲面圖(圖6)，綜合以上，優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)修正為：乙醇濃度70%，加乙醇量8倍，提取次數(shù)2次，提取時間1 h。

圖6 各交互因素等高線和三維曲面

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)，按處方量稱取藥材飲片，加8倍量70%乙醇，提取次數(shù)2次，每次1 h，過濾，濾液按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按含量測定方法測定含量，按干膏得率測定方法測定干膏得率，計(jì)算鹽酸小檗堿含量RSD為0.93%，計(jì)算干膏得率RSD為2.02%。表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

痔瘡是我國醫(yī)學(xué)最早發(fā)現(xiàn)的疾病之一，關(guān)于痔的描述最早見于《山海經(jīng)·西山經(jīng)》：“有鳥，名曰棟，食之已痔?！弊钤缬涊d有關(guān)痔瘡分類和證候的是《五十二病方》，痔瘡的中醫(yī)療法主要有清熱、涼血、解毒等[17-18]，冰硼痔瘡栓能消炎止痛、生肌止血，能夠有效緩解各期痔瘡疼痛和出血，從根本入手，改善機(jī)體的整體狀況，且栓劑在肛腸中應(yīng)用很廣，適合臨床應(yīng)用。

黃連性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可用于治療濕疹、濕瘡等[19]?，F(xiàn)代研究表明，其主要活性成分小檗堿、黃連堿、巴馬亭和藥根堿占總活性堿的95%，小檗堿含量在 50%以上，是其主要抑菌成分[20]。黃柏性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于瘡瘍腫毒、濕疹濕瘡等，也含有小檗堿成分[21]。本研究以鹽酸小檗堿含量測定為評價指標(biāo)，同時測定黃連和黃柏的有效成分，并結(jié)合信息熵賦權(quán)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，科學(xué)合理地優(yōu)選冰硼痔瘡栓提取工藝，為制劑的后期研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。