益氣化痰方調(diào)節(jié)高血壓大鼠腦血管適應(yīng)性功能及炎癥小體的研究

袁冬梅， 張漲， 譚煒， 莫霄云， 林琳， 張清偉， 何貴新

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管二區(qū)，廣西南寧 530023）

大腦是人體靜息狀態(tài)下耗氧量最大的器官，生理狀態(tài)下“功能性充血”是腦循環(huán)關(guān)鍵適應(yīng)性調(diào)節(jié)功能的重要方面。當(dāng)某一腦區(qū)的需氧量上升，內(nèi)皮細(xì)胞會釋放一系列血管活性因子，協(xié)同作用引起血管舒張[1]，使局部大腦血流（CBF）增加，是功能性充血的基礎(chǔ)。高血壓狀態(tài)時，“功能性充血”會發(fā)生改變[2]。Kazama 等[3]在正常血壓小鼠中發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）能明顯抑制刺激誘導(dǎo)的感覺皮層CBF 上升幅度，說明短時間的血壓升高就能改變“功能性充血”。Faraco等[4]的研究表明，內(nèi)皮素1（ET-1）同樣具有改變靜息CBF 和“功能性充血”的效應(yīng)。一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)減少以及一氧化氮（NO）含量降低也是高血壓導(dǎo)致腦循環(huán)調(diào)節(jié)功能障礙的機(jī)制之一[5]。

我們的前期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，益氣化痰方能顯著改善自發(fā)高血壓大鼠動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，具有調(diào)節(jié)自發(fā)性高血壓大鼠腦血管適應(yīng)性功能的作用，而動脈局部的炎癥反應(yīng)是內(nèi)皮功能障礙的重要基礎(chǔ)。因此，我們推測益氣化痰法可能具有改善腦循環(huán)關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能的作用。本研究擬從“功能性充血”入手，評價(jià)益氣化痰方是否能改善ET-1、AngⅡ造成的高血壓大鼠模型的腦循環(huán)調(diào)節(jié)功能，并從炎癥小體的激活方面探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動物24 只SPF 級6 ～8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200 ～250 g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物質(zhì)量合格證號:SYXK 桂2019-0001。本實(shí)驗(yàn)遵循廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動物使用管理規(guī)定，并通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室完成實(shí)驗(yàn)，室內(nèi)溫度20 ～25 ℃，濕度60%～70%，喂食SPF 級大鼠飼料，喂飲無菌水。

1.2藥物、試劑與儀器益氣化痰方由黃芪30 g、茯苓15 g、法半夏10 g、天麻10 g、川芎15 g、炙甘草6 g 組成。上述藥材均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，按處方稱取藥材，加8 倍水，煎煮2 次，每次1 h，合并提取液，濾過備用。替米沙坦（德國勃林格殷格翰公司）。BQ123、ET-1、AngⅡ、乙酰膽堿（美國Sigma Aldrich 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche 公司）；Nod 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）抗體、白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Bioword 公司）。小動物呼吸機(jī)（美國Kent Scientific 公司）；激光多普勒血流儀（瑞士Perimed AB 公司）；Tanon-4100全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.3給藥方法在手術(shù)開始前1 周，益氣化痰方組（簡稱“QPR 組”）和血管緊張素受體拮抗劑（ARB）組的動物分別對應(yīng)預(yù)先灌胃益氣化痰方（給藥量相當(dāng)于飲片3.87 g·kg-1·d-1）和替米沙坦（給藥濃度為0.3 mg·kg-1·d-1[8]），確保實(shí)驗(yàn)時能達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度。其余動物灌胃相同容量的磷酸鹽緩沖液（PBS），設(shè)為PBS組。

1.4一般手術(shù)流程所有的操作都經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會討論并通過。實(shí)驗(yàn)動物用體積分?jǐn)?shù)5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，氣管插管后，接小動物呼吸機(jī)人工通氣，并將異氟烷減少至1.5% ～1.7%，維持麻醉至手術(shù)結(jié)束。加熱板將肛溫維持在37.5 ℃左右。分別穿刺股動脈、股靜脈并留置套管，用以取血樣、監(jiān)測動脈血壓、輸注藥物。所有大鼠靜脈推注0.15 mL肝素（500 IU/mL）以防止鞘管內(nèi)血液凝固堵塞。

1.5靜息CBF和功能性充血反應(yīng)大鼠經(jīng)麻醉后固定，暴露顳骨并鉆一個直徑為1.5 mm 的孔，小心去除硬腦膜，暴露出大腦皮層表面。將激光多普勒血流儀探頭對準(zhǔn)大腦皮層表面并固定，經(jīng)顳窗持續(xù)灌流林格氏液（0.2 mL/h），當(dāng)平均動脈壓（MAP）穩(wěn)定時，測量基線CBF值。然后分別經(jīng)靜脈泵入ET-1（50 pmol·kg-1·min-1）、AngⅡ（0.25 μg·kg-1·min-1）制作2 種高血壓模型，ET-1、AngⅡ均溶解于林格氏液中；單獨(dú)泵入林格氏液（0.2 mL/h）的大鼠作為空白對照組。30 min 后，當(dāng)MAP 達(dá)到穩(wěn)態(tài)時，通過觸須刺激（3 ～5 Hz，60 s）誘發(fā)功能性充血，再次測量CBF 值。用于觀察BQ123 拮抗作用的大鼠，在靜脈泵入ET-1 的同時，其顳窗灌流液應(yīng)更換為含有BQ123（1 μmol/L）的林格氏液。

為了檢測腦血管內(nèi)皮依賴性的充血反應(yīng)，將乙酰膽堿（10 μmol/L）經(jīng)顳窗局部灌流至大腦皮層表面，記錄CBF 的變化。乙酰膽堿可通過激活eNOS 釋放NO 作用于血管平滑肌使血管擴(kuò)張，被滴注到顳窗后，CBF上升，3 ～5 min達(dá)到穩(wěn)態(tài)。通過對比藥物刺激前后CBF 的變化幅度，分別檢測腦血管內(nèi)皮依賴性的充血反應(yīng)。CBF的變化以相對于基線水平的升高百分比表示，根據(jù)如下公式計(jì)算:CBF 升高百分比（%）=（CBF最大值- CBF基線）/CBF基線×100%。

1.6蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測主動脈炎癥小體的表達(dá)末次給藥后禁食24 h 后處死大鼠，迅速開胸，分離主動脈、剪下后放置在濾紙上吸干，放入EP 管中，于-80 ℃保存，用于后續(xù)的Western Blot 檢測。將主動脈組織在PBS 中清洗，繼而在含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中研磨（全程置于冰上），以12 000 r/min 4 ℃離心20 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP 管中，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液，將等量的蛋白質(zhì)溶液上樣到預(yù)制的12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）膠上，垂直電泳，再濕法電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。以含50 g/L 脫脂牛奶的TBST（Tris-buffered saline containing 0.1% Tween 20）溶液室溫封閉2 h。分別在含有下列一抗的溶液中4 ℃孵育過夜:NLRP3 抗體（1∶500 稀釋）、IL-1β 抗體（1∶500 稀釋），GAPDH 抗體（1∶10 000 稀釋）做為內(nèi)參。分別用含有下列二抗的溶液室溫下孵育1 h:辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶2 000 稀釋）或辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋）。最后將配制好的DAB 工作液滴加到印記膜上，孵育1 ～5 min 顯色，用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)成像。用ImageJ 軟件進(jìn)行條帶灰度分析，所有的目標(biāo)蛋白定量均用GAPDH 進(jìn)行均一化。數(shù)據(jù)結(jié)果以PBS 組作為基準(zhǔn)，其余2 組的目的蛋白表達(dá)量與其進(jìn)行對比來表示。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，如果符合正態(tài)分布，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，否則即采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1預(yù)先給藥對大鼠靜息CBF的影響為了觀察預(yù)先給予益氣化痰方、替米沙坦以及BQ123 對大鼠靜息CBF 的影響，在固定好激光多普勒探頭后，經(jīng)顳窗持續(xù)灌流林格氏液（0.2 mL/h），BQ123 組的大鼠則灌流含BQ123 的林格氏液（1 μmol/L），當(dāng)MAP穩(wěn)定時，測量基線CBF值。

圖1結(jié)果顯示:預(yù)先給予益氣化痰方灌胃、替米沙坦灌胃以及灌注BQ123的大鼠靜息CBF分別為（128.0±7.7）p.u.、（126.7±9.7）p.u.、（127.0±8.1）p.u.，與灌胃PBS 的大鼠靜息CBF（124.4 ± 9.1）p.u.比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明預(yù)先給藥對于大鼠的靜息CBF無明顯影響。

2.2益氣化痰方減輕AngⅡ?qū)Υ笫蟠竽X皮層功能性充血的影響采用重復(fù)撓撥大鼠顳窗對側(cè)的觸須測量大腦皮層功能性充血。圖2結(jié)果顯示:泵入AngⅡ的大鼠大腦皮層CBF 上升幅度較泵入林格氏液的大鼠明顯降低（P＜0.05）。AngⅡ+QPR 組、AngⅡ+ARB 組的CBF 上升幅度高于單純泵入AngⅡ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明益氣化痰方和替米沙坦均能明顯減輕AngⅡ?qū)Υ笫竽X循環(huán)充血反應(yīng)的影響。

圖1 預(yù)先給藥對大鼠靜息基線大腦血流（CBF）的影響（±s，每組8只）Figure 1 Effects of various pretreatment on rat baseline CBF（±s，8 rats in each group）

圖2 益氣化痰方（QPR）減輕AngⅡ?qū)Υ笫蟠竽X皮層功能性充血的影響（±s，每組8只）Figure 2 QPR reduces the effects of AngⅡon functional hyperemia in rat cerebral cortex（±s，8 rats in each group）

2.3益氣化痰方減輕ET-1對大鼠大腦皮層功能性充血的影響仍采用重復(fù)撓撥大鼠顳窗對側(cè)的觸須測量大腦皮層功能性充血。圖3結(jié)果顯示:泵入ET-1 的大鼠大腦皮層CBF 上升幅度較泵入林格氏液的大鼠明顯降低（P＜0.05）。ET-1 + QPR 組、ET-1 + BQ123 組的CBF 上升幅度高于單純泵入ET-1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明益氣化痰方和BQ123 均能明顯減輕ET-1 對大鼠大腦皮層充血反應(yīng)的影響。

圖3 益氣化痰方（QPR）減輕ET-1對大鼠大腦皮層功能性充血的影響（±s，每組8只）Figure 3 QPR reduces the effects of ET-1 on functional hyperemia in rat cerebral cortex（±s，8 rats in each group）

2.4各組大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性充血反應(yīng)情況的比較將乙酰膽堿（10 μmol/L）經(jīng)顳窗局部灌流至大腦皮層表面，記錄CBF 的變化，檢測腦血管內(nèi)皮依賴性的充血反應(yīng)。預(yù)先給予益氣化痰方、替米沙坦和BQ123均不影響PBS組的CBF上升幅度。

圖4 結(jié)果顯示:泵入Ang Ⅱ的大鼠大腦皮層CBF 上升幅度較泵入林格氏液的大鼠明顯降低（P＜0.05）。AngⅡ+ QPR 組、AngⅡ+ ARB 組的CBF 上升幅度高于單純泵入AngⅡ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。泵入ET-1的大鼠的CBF上升幅度較泵入林格氏液的大鼠明顯降低（P＜0.05）。ET-1+QPR 組、ET-1+BQ123 組的CBF 上升幅度高于單純泵入ET-1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 ）。

說明益氣化痰方均能明顯減輕AngⅡ和ET-1對大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性充血反應(yīng)的影響。

2.5各組大鼠主動脈NLRP3和IL-1β的表達(dá)水平比較NLRP3 是炎癥小體的重要組成部分，炎癥小體通過激活Caspase-1 進(jìn)而切割I(lǐng)L-1β 前體，生成剪切型IL-1β，即為成熟的促炎因子IL-1β。通過檢測各組大鼠主動脈組織中的NLRP3 和剪切型IL-1β 蛋白的表達(dá)，圖5 結(jié)果顯示:與PBS 組比較，灌服替米沙坦和益氣化痰方大鼠主動脈的NLRP3 和剪切型IL-1β 蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明預(yù)先灌服益氣化痰方和替米沙坦均能抑制大鼠主動脈組織中NLRP3和剪切型IL-1β的表達(dá)。

圖4 各組大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性充血反應(yīng)情況比較（±s，每組8只）Figure 4 Comparison of endothelial dependent hyperemia response in cerebral vessels of various groups（±s，8 rats in each group）

圖5 各組大鼠主動脈NLRP3和IL-1β的表達(dá)水平比較（±s，每組8只）Figure 5 Comparison of the expression levels of NLRP3 and IL-1β in aorta tissue of various groups（±s，8 rats in each group）

3 討論

本研究主要觀察了益氣化痰方對高血壓大鼠模型的腦血管適應(yīng)性調(diào)節(jié)功能的影響。分別泵入Ang Ⅱ和ET-1 造成2 種高血壓模型后，通過重復(fù)撓撥大鼠顳窗對側(cè)的觸須，以及經(jīng)顳窗局部灌流乙酰膽堿溶液，檢測大腦皮層的充血反應(yīng)。結(jié)果顯示，泵入AngⅡ或ET-1 后，大鼠大腦皮層的CBF 上升幅度明顯減小，預(yù)先1 周給予益氣化痰方能顯著減輕Ang Ⅱ和ET-1 對大鼠大腦皮層充血反應(yīng)的影響。

功能性充血反應(yīng)是腦循環(huán)關(guān)鍵適應(yīng)性功能的重要方面。腦組織的血液供應(yīng)并不是均等的，不同腦區(qū)的能量需求不同，血液供應(yīng)也有差別。當(dāng)某一腦區(qū)的神經(jīng)元功能活躍時，需氧量上升，此時局部CBF 就會增加，這就是“功能性充血”。神經(jīng)元活動增加時，腦動脈內(nèi)皮細(xì)胞通過釋放血管舒張因子（如NO）和收縮因子（如內(nèi)皮素）對血管張力產(chǎn)生影響[9-10]。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管活性物質(zhì)參與調(diào)節(jié)靜息狀態(tài)的血管張力，也參與協(xié)調(diào)腦實(shí)質(zhì)小動脈和腦膜下動脈之間的血管舒縮反應(yīng)，使局部CBF增加。

高血壓時，功能性充血也會發(fā)生改變。在長期高血壓的患者中，通過刺激某一腦區(qū)的活動而誘發(fā)的CBF 增加，其上升幅度明顯低于正常血壓患者[11-12]。經(jīng)靜脈全身給予AngⅡ造成血壓升高，此時，刺激胡須誘導(dǎo)的感覺皮層CBF 上升幅度受到明顯抑制[3]，說明AngⅡ?qū)е隆肮δ苄猿溲钡母淖儼l(fā)生在血管重構(gòu)之前。ET-1 也同樣具有改變靜息CBF 和“功能性充血”的效應(yīng)[4]。

預(yù)先灌胃益氣化痰方能顯著改善AngⅡ和ET-1對大鼠大腦皮層功能性充血反應(yīng)的影響，其升高幅度與替米沙坦和BQ123類似。替米沙坦和BQ123分別是AngⅡ受體和ET-1 受體的特異性拮抗劑，既往的研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦[8]和BQ123[4]能拮抗AngⅡ和ET-1 對功能性充血反應(yīng)的影響，說明益氣化痰方也具有拮抗Ang Ⅱ或ET-1 對腦血管調(diào)節(jié)功能影響的作用。

炎性小體（inflammasome）是由胞漿內(nèi)模式識別受體（PRRs）參與組裝的多蛋白復(fù)合物。炎癥小體能夠識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或者宿主來源的危險(xiǎn)信號分子（DAMPs），招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1。活化Caspase-1 切割I(lǐng)L-1β 和IL-18的前體，產(chǎn)生成熟的炎癥因子。

直到最近，研究者才發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體在高血壓中的重要作用。在“兩腎一夾”高血壓模型中，敲除NLRP3 或ASC 能阻止血壓升高、降低腎素水平[13]。在ATP 誘導(dǎo)的高血壓模型中，Caspase-1 抑制劑WEHD 也可降低血壓、減少水鈉潴留，降低炎癥因子IL-1β 水平[14]。超氧離子清除實(shí)驗(yàn)表明，炎癥小體的激活與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[15]，激活的炎癥小體能通過IL-1β 觸發(fā)固有免疫反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終引起內(nèi)皮功能不全[16]。這些結(jié)果說明，炎癥小體激活可能是高血壓的發(fā)展過程中動脈內(nèi)皮功能損害的重要機(jī)制，炎癥小體可作為高血壓治療的新靶點(diǎn)。本研究通過分析大鼠主動脈組織中NLRP3 和剪切型IL-1β 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)預(yù)先灌服益氣化痰方能抑制NLRP3 和剪切型IL-1β的表達(dá)，提示益氣化痰方可能是通過影響炎癥小體的激活，進(jìn)而減輕動脈壁的炎癥反應(yīng)，最終改善動脈的內(nèi)皮依賴性舒張功能。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為眩暈的病位在“腦”。痰濁在眩暈的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。臨床上單純以痰濁為病因的患者少見，氣虛與痰濁常互為因果，形成惡性循環(huán)，老年患者氣虛痰濁并見者多見。我們既往的研究[18]發(fā)現(xiàn)氣虛痰濁型患者的腦血管調(diào)節(jié)功能較差，據(jù)此我們認(rèn)為，氣虛痰濁是高血壓導(dǎo)致腦循環(huán)功能障礙的關(guān)鍵病機(jī)，病變的主要臟腑為腦。益氣化痰方是以氣虛痰濁證為證候基礎(chǔ)配伍組方的，由黃芪、茯苓、法半夏、天麻、川芎組成。方中:重用黃芪補(bǔ)脾益氣，脾胃健則清陽升，痰濕自去，為君藥；茯苓、半夏健脾祛濕，取“小半夏加茯苓湯”之意，并可加強(qiáng)黃芪補(bǔ)氣之力，為臣藥；天麻祛風(fēng)定眩，川芎引藥上行，共為佐使藥。諸藥共用，不僅中焦痰濕得化，還可使藥力上行，直達(dá)腦部，共奏健脾益氣、化痰定眩之功。本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，益氣化痰方具有改善高血壓大鼠模型的腦循環(huán)調(diào)節(jié)功能的作用，可與其理論基礎(chǔ)相互印證。

綜上所述，本研究從大腦皮層的功能性充血入手，評價(jià)了益氣化痰方對改善高血壓大鼠模型腦循環(huán)調(diào)節(jié)功能的影響。研究結(jié)果提示，益氣化痰方能部分改善高血壓大鼠的腦循環(huán)適應(yīng)性調(diào)節(jié)功能，其作用機(jī)制與阻斷炎癥小體激活有關(guān)。