干細胞治療生殖系統(tǒng)疾病的研究進展

劉紫君，?；?，王宇，吳效科

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040)

干細胞是一種具有無限自我更新、多向分化潛能的未成熟原始細胞，可分裂出表現(xiàn)型和基因型與自己完全相同的子代細胞。特定條件下，干細胞還可定向分化為不同胚層的特定組織類型細胞，比如角質(zhì)形成細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、骨細胞、心肌細胞以及肝細胞等。干細胞移植是將干細胞通過細胞學方法提取出來，體外分離后再移植入患者體內(nèi)，通過其分化或旁分泌功能，發(fā)揮修復受損組織、改善組織器官功能的作用。鑒于移植后成瘤的風險和倫理爭議，干細胞中的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cell，MSC)成為對于自體以及異源細胞替代治療而言最有前途的醫(yī)療工具。1957年報道了首例造血干細胞移植成功的案例，目前干細胞研究涉及了多個領域，主要包括視網(wǎng)膜病變、免疫系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、心腦血管疾病、骨科疾病等[1]。

生殖系統(tǒng)是維護人類健康及繁衍的重要系統(tǒng)，大量的研究證明，干細胞移植對生殖系統(tǒng)疾病如子宮內(nèi)膜損傷或卵巢早衰等治療效果顯著，且不良反應少?，F(xiàn)就生殖系統(tǒng)幾種常見疾病的干細胞治療作用及機制研究進展進行綜述。

一、卵巢早衰(POF)

POF以卵巢功能過早衰竭為主要臨床表現(xiàn)，臨床生殖激素檢查多表現(xiàn)為雌激素水平降低和促性腺激素水平增高。目前常規(guī)的治療方法難以恢復卵巢的正常功能，而多種來源干細胞治療POF的研究已取得了令人振奮的結果，成為臨床治療POF的理想選擇。Chen等[2]的一項針對干細胞治療POF的薈萃分析顯示，納入研究的多種來源干細胞包括人臍帶MSC、脂肪來源的干細胞、源自人誘導的多能干細胞(PSC)的卵巢顆粒樣細胞、人羊膜上皮細胞、人臍帶血單核細胞、人子宮內(nèi)膜MSC、骨髓來源的MSC、皮膚來源的MSC及microRNA-17-3p轉染的人誘導的PSC，其干細胞移植均可以增加POF模型動物的卵巢重量，平衡血清激素水平，增加妊娠次數(shù)以及恢復生育能力，顯著改善了POF模型動物的卵巢功能，證明了干細胞移植治療POF的潛力。推測干細胞的療效可能歸因于干細胞的分化、歸巢和旁分泌功能。

1.骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)：2016 年有研究人員將BMSC移植到10例POF患者卵巢中，數(shù)月后患者的Edessy卵巢儲備評分(EORS)均有所改善，2例恢復月經(jīng)，且有1例在11 個月后懷孕并分娩健康足月嬰兒[3]。Gabr等[4]的一項針對30 例POF患者的實驗中，有26例在移植了自體BMSC后雌激素、抗苗勒管激素(AMH)水平上升，F(xiàn)SH水平下降，其中18例重新排卵，且有1例自然妊娠。而在動物實驗方面，Mohamed等[5]對化療誘導的卵巢功能衰竭模型小鼠的卵巢內(nèi)注射干細胞，結果發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢激素水平和卵泡發(fā)育均有所改善。也有研究對靜脈注射的BMSC進行了追蹤，發(fā)現(xiàn)卵巢和髓質(zhì)中BMSC的數(shù)量大于皮質(zhì)，但在卵泡和黃體中未發(fā)現(xiàn)BMSC[6]。Fu等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21的BMSC移植可抑制POF模型大鼠的顆粒細胞凋亡，使卵巢重量和卵泡數(shù)量增加、激素水平升高，這可能與過表達mir-21的BMSC下調(diào)了凋亡相關基因PTEN和PDCD4表達有關。而Yang等[8]發(fā)現(xiàn)，應用BMSC治療環(huán)磷酰胺誘導的POF模型大鼠的衰竭卵巢時，BMSC來源外泌體中的miR-144-5p抑制顆粒細胞的凋亡，促進卵巢功能的恢復。Chen等[9]對BMSC先進行了熱休克處理，再注入POF模型大鼠的雙側卵巢，結果顯示卵巢重量、雌二醇水平以及不同階段的卵泡數(shù)量增加，卵泡刺激素水平下降，顆粒細胞凋亡減少。更重要的是，經(jīng)過預處理的BMSC對化療期間的微環(huán)境耐受性增強，一定程度上解決了移植細胞存活率低的問題。

2.羊水干細胞(AFSC)：AFSC形態(tài)學特征、免疫表型和中胚層分化潛能與間充質(zhì)干細胞類似，增殖比MSC更快，可以表達多能性標志物-八聚體結合轉錄因子(OCT4)。因其處于原始階段，免疫原性較低、易于獲取，為再生醫(yī)學提供了新的干細胞來源。Xiao等[10]發(fā)現(xiàn)，AFSC移植可以通過預防卵泡閉鎖和維持健康卵泡的機制來改善化療所致POF小鼠的生殖能力，但在體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)AFSC分化成的顆粒細胞和生殖細胞。另一項針對AFSC外泌體的研究證實，AFSC來源的外泌體通過下調(diào)miR-146a和miR-10a兩種微小RNA，能夠預防化療所致POF小鼠的卵巢濾泡閉鎖，由此認為miR-10a具有作為治療POF的新型試劑的潛力[11]。

3.胎盤源性MSC(ES-MSC)：有研究比較了ES-MSC與BMSC對化療所致POF大鼠卵巢功能的保護作用，發(fā)現(xiàn)ES-MSC也可以保護卵巢組織結構，恢復卵巢功能，改善生育能力，且ES-MSC相較于BMSC增殖能力更高，更易獲取[12]。Yoon等[13]發(fā)現(xiàn)，人胎盤源性MSC(hES-MSC)能夠修復順鉑所致的卵巢結構和功能損傷，妊娠率和活產(chǎn)率也得到顯著改善。Liu等[14]則發(fā)現(xiàn)，靜脈移植ES-MSCs的細胞外囊泡可通過PI3K-AKT信號通路促進顆粒細胞增殖，改善卵巢功能，為干細胞治療POF提供了另一種思路。

4.臍帶MSC(UCMSC)：Elfayomy等[15]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶血MSC(hUCMSC)可以通過調(diào)節(jié)細胞角蛋白8/18(CK 8/18)、轉化生長因子-β(TGF-β)和增殖細胞核抗原(PCNA)的組織表達，以及對卵巢上皮細胞和/或間接富集卵巢細胞的直接觸發(fā)作用來恢復注射紫杉醇后的大鼠卵巢功能，這些分子在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生和抑制胱天蛋白酶3(CASP-3)誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Wang等[16]的研究也證實了hUCMSC可以促進顆粒細胞增殖，改善卵巢功能，且改善程度與hUCMSC劑量呈正相關。有研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSC是通過促進血紅素加氧酶-1(HO-1)表達來改善卵巢功能的[17]。另有研究比較了靜脈注射和卵巢原位注射兩種移植hUCMSC的方法療效，結果顯示靜脈注射組比卵巢原位注射組更有利于恢復卵巢功能，同時檢測發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶2和抗凋亡酶的基因CAT表達增加，推測hUCMSC的作用機制與其抗細胞氧化和抗凋亡相關[18]。子宮屬于空腔臟器，干細胞因缺少附著點導致其存活率較低，達不到預期效果，因此人們將干細胞附著于生物材料上以延長其在卵巢組織中的停留時間。研究者將hUCMSC與可降解的膠原蛋白共同制成凝膠狀支架，體外實驗發(fā)現(xiàn)，膠原/hUCMSC凝膠支架上的干細胞可以通過叉頭狀轉錄因子3a(FOXO3a)和FOXO1的磷酸化激活原始卵泡；體內(nèi)實驗將膠原/hUCMSC凝膠支架移植到8例POF患者的卵巢中，發(fā)現(xiàn)其可改善卵巢整體功能，且移植后2例POF患者妊娠成功[19]。

5.脂肪來源干細胞(ADSC)：Su等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膠原/ADSC的共同移植可以延長ADSC在卵巢中的停留時間，并有助于改善卵巢損傷大鼠的卵巢功能及生育能力。

6.經(jīng)血來源MSC(MenSCs)：大多數(shù)類型的干細胞要么難以獲得，要么獲取涉及侵入性操作，而MenSCs比較容易獲取。Wang等[21]認為MenSCs有間充質(zhì)干細胞樣特性，通過小鼠尾靜脈輸注MenSCs，發(fā)現(xiàn)MenSCs可以抑制顆粒細胞凋亡、卵巢間質(zhì)纖維化，改善卵巢微環(huán)境，從而增加卵泡數(shù)量，恢復性激素水平，在此過程中發(fā)現(xiàn)移植的MenSC定向遷移至卵巢間質(zhì)，但沒有直接分化為卵母細胞。

二、子宮內(nèi)膜受損

子宮內(nèi)膜損傷在臨床上較為多見，病因主要為Asherman’s 綜合征或稱宮腔粘連(IUA)。子宮內(nèi)膜受損使宮腔部分或全部閉塞，從而導致月經(jīng)異常、不孕或不良妊娠結局等。

1.骨髓干細胞(BMDSC)：一項應用BMDSC治療11例Asherman’s 綜合征患者和5例子宮內(nèi)膜萎縮患者的實驗性研究中，15例患者在干細胞治療2個月后子宮內(nèi)膜增厚，新生血管形成且月經(jīng)恢復，其中3 例患者自發(fā)懷孕[22]。動物實驗方面，通過尾靜脈注射移植BMDSC后，大鼠子宮內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜標記物如細胞角蛋白、波形蛋白、整合素αβγ3和白血病抑制因子的表達顯著增強，而促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β mRNA表達顯著下調(diào)，故認為BMDSC可能通過其遷移分化和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[23]。早前有研究發(fā)現(xiàn)，在體外適當條件下，BMDSC可向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化，且17β-雌二醇可能在此過程中發(fā)揮重要作用[24]。但Ong等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜中未觀察到骨髓干細胞衍生的基質(zhì)、粘膜上皮或內(nèi)皮細胞，而是一些巨噬細胞，這些巨噬細胞在基質(zhì)中分布廣泛，可遷移到上皮和血管區(qū)，很容易被誤認為是骨髓來源的子宮內(nèi)膜細胞，據(jù)此他們認為骨髓干細胞不太可能分化為子宮內(nèi)膜基質(zhì)、上皮細胞和內(nèi)皮細胞。但不管其分化結果如何，臨床試驗和動物實驗都證實了BMDSC可改善子宮內(nèi)膜損傷。Zhou等[26]將富血小板血漿(PRP)與BMDSC聯(lián)合應用于IUA模型大鼠，發(fā)現(xiàn)PRP激活后通過釋放的胰島素樣生長因子1和白細胞介素10促進BMDSC分化，使治療效果更加顯著。還有研究提取了BMDSC的外泌體注射到IUA小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)也能夠修復受損的子宮內(nèi)膜，體外培養(yǎng)能促進細胞增殖和細胞遷移[27]。這些研究都另辟蹊徑，從其他角度證實了BMDSC的功效。

2.臍帶MSC(UCMSC)：體外適當條件下，UCMSC可分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞。有研究者將膠原/UCMSC凝膠支架移植到26 例IUA患者子宮腔中，結果顯示患者的平均子宮內(nèi)膜厚度增加，宮內(nèi)粘連評分低于治療前；隨訪30個月，截止結束時26 例患者中有10例已經(jīng)懷孕，其中8例分娩，并無明顯的并發(fā)癥[28]。吳林等[29]使用凍干羊膜聯(lián)合hUCMSC移植入IUA患者宮腔內(nèi)，結果顯示可有效改善IUA，促進內(nèi)膜的再生修復。Zheng等[30]通過標記發(fā)現(xiàn)移植的hUCMSC大部分分布于子宮內(nèi)膜和腺體的間質(zhì)，上皮則較少，提示hUCMSC具有分化為上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和雌激素受體細胞的能力，可以增加血液供應，抑制纖維化，并改善IUA模型的生育能力。

3.經(jīng)血來源MSC(MenSCs)：一項關于7例重度Asherman’s綜合征患者自體移植MenSCs的實驗研究發(fā)現(xiàn)，有5例患者的子宮內(nèi)膜厚度顯著增厚，其中4例患者接受了凍融胚胎移植，3例成功受孕[31]。Ma等[32]同樣在12例IUA患者的實驗中取得良好進展，MenSCs自體移植后，患者均有子宮內(nèi)膜增厚，且有5 例成功妊娠。另一項體外研究將hMenSCs移植到子宮內(nèi)膜機械損傷模型小鼠的子宮腔中，結果顯示移植組子宮內(nèi)膜厚度增加，妊娠率增加，認為MenSCs可能通過促進波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和角蛋白的表達促進小鼠子宮內(nèi)膜病變的修復[33]。為研究MenSCs的信號通路，Zhu等[34]使用米非司酮損傷人胚胎干細胞，隨后與MenSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MenSCs顯著恢復了受損胚胎干細胞的增殖和遷移能力，并且上調(diào)了P-AKT，P-p38，VEGF和β-連環(huán)蛋白的蛋白表達，因此該研究認為AKT和p38信號通路可能參與了MenSCs恢復細胞損傷的過程。Chen等[35]則發(fā)現(xiàn)與尾靜脈注射相比，通過宮內(nèi)支架移植MenSCs更能促進IUA大鼠子宮內(nèi)膜再生。Chang等[36]對MenSCs的移植安全性進行了研究，發(fā)現(xiàn)移植后IUA大鼠無急性、亞慢性、慢性中毒、感染、腫瘤發(fā)生及子宮內(nèi)膜異位癥。MenSCs優(yōu)勢眾多，但對于經(jīng)血量少甚至閉經(jīng)的患者，會存在MenSCs收集困難的問題，在臨床應用中應加以注意。

4.脂肪來源干細胞(ADSC)：研究證實，骨髓源性、胚胎源性和經(jīng)血源性干細胞均對子宮內(nèi)膜損傷有改善作用，但這些干細胞來源數(shù)量少且存在倫理爭議、收集困難等實際問題。ADSC來源廣泛，且更易實現(xiàn)自體移植，倫理爭議及免疫排斥少，逐漸成為修復子宮內(nèi)膜的干細胞來源之一?？椎聞賉37]將ADSC進行原位肌層間注射移植，發(fā)現(xiàn)對子宮內(nèi)膜的改善效果不明顯，而使用小腸黏膜下基質(zhì)與ADSC復合移植后，可顯著改善子宮內(nèi)膜病理形態(tài)學指標，促進內(nèi)膜生長，減少纖維化，提高內(nèi)膜容受性，改善妊娠結局。近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，將含有脂肪干細胞的脂肪組織注入IUA患者的子宮后，患者月經(jīng)情況得到不同程度的恢復，但并未提高妊娠率[38]。Zhao等[39]研究證實，ADSC來源的外泌體可促進子宮內(nèi)膜再生和生育能力恢復，故子宮局部應用ADSC外泌體有望成為治療嚴重宮腔粘連和不孕癥的一種有前途的治療策略。

5.胎盤源性 MSC(PMSC)：PMSC具有取材無創(chuàng)性、來源豐富、標本易于獲取，且免疫原性低，可多向分化等優(yōu)勢，但目前相關研究還比較少。有研究比較了宮腔局部或尾靜脈注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細胞兩種方式，發(fā)現(xiàn)均可不同程度地修復大鼠子宮內(nèi)膜損傷組織，增加子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量，改善子宮內(nèi)膜容受性，其中尾靜脈組移植取得的效果更佳[40]。

三、盆腔臟器脫垂(POP)

POP是困擾圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期患者的一種疾病，常用的治療方法是植入合成網(wǎng)，然而合成網(wǎng)植入后的嚴重并發(fā)癥限制了其應用，因此將干細胞應用于POP的治療也應運而生，通過將多種干細胞接種到合成網(wǎng)上植入患者體內(nèi)，以提高網(wǎng)狀物的生物相容性，從而改善其生物力學行為，有效修復盆底。

1.子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞(eMSC)：eMSC因其存在位置較其他來源的MSC對于修復盆底臟器更具有優(yōu)勢，且更易方便獲取，成為一個有潛力的干細胞來源。Chen等[41]在體外誘導eMSC分化為陰道平滑肌細胞(SMC)，為eMSC治療POP提供了理論基礎。Mukherjee等[42]將eMSC+納米纖維網(wǎng)植入模型小鼠皮膚創(chuàng)傷處，可以有效減輕急性炎癥反應，促進胞外基質(zhì)合成、血管生成和抗炎基因表達，形成新的膠原，提示eMSC+納米纖維網(wǎng)能促進創(chuàng)傷愈合，可以作為治療POP的替代性外科結構。

2.骨骼肌來源干細胞(MDSC)：MDSC已從人體骨骼肌中分離出來，體外和體內(nèi)均可分化為骨骼肌肌管、成骨細胞、軟骨細胞和神經(jīng)細胞。研究發(fā)現(xiàn)，來自成人組織(如骨髓或骨骼肌)的干細胞比胚胎干細胞具有更低的癌變和免疫排斥風險[43]。此前研究將MDSC覆蓋在支架上植入模型大鼠，結果顯示MDSC復合支架可刺激上皮形成并保持適當?shù)慕M織學外觀，促進陰道組織再生修復，推測自體移植MDSC可有效修復陰道[44]。

3.脂肪來源干細胞(ADSC)：ADSC在體外可被誘導分化為成纖維細胞，將ADSC聯(lián)合組織工程化筋膜移植入裸鼠皮下，可形成與正常筋膜相似的形態(tài)良好的層狀結構。因此ADSC有望用來修復POP。

4.臍帶間充質(zhì)干細胞(UCMSC)：研究顯示，UCMSC與筋膜或納米纖維等結合植入動物模型后，UCMSC組膠原含量高于未結合UCMSC組，提示UCMSC可以調(diào)節(jié)這種復合體的生物學性能，在盆底醫(yī)學領域有很大的應用潛力[45]。

綜上所述，各種來源的干細胞在生殖健康領域的應用前景是非常廣闊的，其中涉及到的機制可能包括：(1)干細胞在適當?shù)恼T導條件下分化成靶細胞；(2)干細胞分泌的生長因子可刺激植入成功的干細胞恢復宿主細胞功能；(3)外源性干細胞與內(nèi)源性干細胞聯(lián)合修復受損組織功能。相關研究都取得了令人振奮的結果，但很多問題仍需要我們正視并解決：干細胞應用研究多是動物模型層面，應用于人體的療效仍需大量臨床試驗證明；干細胞在靶器官的植入方法和停留時間存在缺陷，很多研究缺乏切實的分化證據(jù)；移植治療的安全性和有效性需進一步考證，異體來源的干細胞仍存在倫理爭議等等。以上種種仍需醫(yī)學工作者和研究者進行深入的分析和研究，以期早日實現(xiàn)干細胞在臨床上的常規(guī)及廣泛應用，為廣大患者的治療帶來福音。