泛素化修飾在DNA 損傷修復(fù)中的功能研究進(jìn)展

秦小兵

（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，武漢 430061）

基因組的穩(wěn)定性時(shí)刻遭受到各種各樣的損傷威脅，如代謝產(chǎn)物、離子輻射（IR）、紫外線（UV）以及復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致的DNA 損傷［1］。細(xì)胞內(nèi)常見的DNA 損傷類型有DNA 單連斷裂、DNA 雙鏈斷裂、堿基缺失或錯(cuò)配、DNA-蛋白交聯(lián)、DNA-DNA 交聯(lián)等損傷類型。這些DNA 損傷如果不能及時(shí)修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤以及范可尼貧血癥等疾病［2］。因此，細(xì)胞必須維持基因組的穩(wěn)定性，為了維持基因組的穩(wěn)定性，細(xì)胞會(huì)采取許多措施來修復(fù)損傷的DNA。細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性的措施主要有堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）、同源重組修復(fù)（HRR）以及非同源性末端連接（NHEJ）等方式。

在以上DNA 修復(fù)過程中，細(xì)胞內(nèi)大量的修復(fù)因子參與這些過程，其中許多修復(fù)因子在修復(fù)過程中會(huì)發(fā)生翻譯后修飾，這些修飾與DNA 損傷修復(fù)密切相關(guān)，常見的翻譯后修飾包括泛素化、甲基化以及乙?；?。本研究詳細(xì)闡述了泛素化修飾在DNA 損傷修復(fù)過程中的研究現(xiàn)狀以及相關(guān)進(jìn)展，從而為相關(guān)疾病的治療和基礎(chǔ)研究提供相應(yīng)的參考和理論依據(jù)。

1 泛素化修飾

泛素是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的由76 個(gè)氨基酸組成的小分子，在細(xì)胞內(nèi)可以以游離或者與其他蛋白結(jié)合在一起的狀態(tài)存在［3］。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化修飾時(shí)需要有泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的參與，此外還需要消耗ATP 分子。蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化修飾需要3 個(gè)步驟：第一步，E1 消耗1 個(gè)ATP 分子將泛素連接到自身的半胱氨酸殘基上從而將泛素活化；第二步，E1 將活化的泛素分子連接到泛素結(jié)合酶E2 上；第三步，泛素結(jié)合酶E2 與泛素連接酶E3 結(jié)合（圖1），從而將泛素分子連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上［4-6］。泛素分子與底物蛋白的結(jié)合方式有多種，目前常見的有K6、K11、K27、K29、K33、K48 和K63 等多種結(jié)合方式［7］。

圖1 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化修飾過程

2 泛素化修飾在堿基切除修復(fù)中的作用

泛素化修飾在堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）、同源重組修復(fù)（HRR）以及非同源性末端連接（NHEJ）等修復(fù)方式中都扮演著重要角色，下面對(duì)泛素化修飾在各種機(jī)制中的作用進(jìn)行討論。

DNA 復(fù)制時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的DNA 損傷，這些損傷包括堿基錯(cuò)配、缺失等情況，因而堿基切除修復(fù)（BER）對(duì)于維持基因組穩(wěn)定性是非常重要的，DNA復(fù)制后修復(fù)（PRR）能夠?qū)NA 復(fù)制過程中產(chǎn)生的大量的DNA 損傷得到修復(fù)，從而維持基因組的穩(wěn)定性。在研究DNA 復(fù)制后修復(fù)過程中，Rad6（人類細(xì)胞中Rad6 對(duì)應(yīng)的蛋白是HR6A∕UBE2A 和HR6B∕UBE2B）是第一個(gè)在酵母中發(fā)現(xiàn)的與DNA 復(fù)制后修復(fù)有關(guān)的蛋白［8］，Rad6 是一個(gè)泛素結(jié)合酶（E2），它與泛素連接酶Rad18（E3，人類細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的是RAD18）一起介導(dǎo)PCNA 的單泛素化修飾。當(dāng)PCNA 的164 賴氨酸發(fā)生泛素化之后，它會(huì)募集參與DNA 損傷修復(fù)的DNA 聚合酶，如DNA 聚合酶η、DNA 聚合酶κ 等蛋白到發(fā)生了泛素化修飾的PCNA 上，從而使細(xì)胞進(jìn)行跨損傷合成（TLS）修復(fù)途徑［9］。而且有報(bào)道稱，在酵母中Rad5（E3，人類細(xì)胞中是SHPRH 和HLTF）會(huì)與Ubc13-Mms2（E2）一起介導(dǎo)PCNA 的多泛素化修飾，該修飾會(huì)促進(jìn)染色體的復(fù)制，從而使得DNA 損傷能通過復(fù)制產(chǎn)生的姐妹染色單體來進(jìn)行修復(fù)，即通過同源重組這條途徑來修復(fù)損傷的DNA［10］（圖2）。

圖2 泛素化在堿基切除修復(fù)中的功能

DNA 在復(fù)制或是轉(zhuǎn)錄過程中，DNA 的鏈間會(huì)發(fā)生一些交聯(lián)（ICLs），這種交聯(lián)如果不能得到及時(shí)修復(fù)，會(huì)影響基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程，從而引起疾病的發(fā)生，這種交聯(lián)是依賴于堿基切除修復(fù)的方式進(jìn)行修復(fù)的。而在范可尼貧血癥患者中，由于缺少DNA 交聯(lián)修復(fù)的相關(guān)蛋白，因而這些病人的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程都會(huì)受到影響［2］。目前，發(fā)現(xiàn)這些病人中有15 個(gè)等位基因會(huì)發(fā)生突變，這些基因統(tǒng)稱為FA，這些基因的產(chǎn)物是在DNA 交聯(lián)修復(fù)的最初3 個(gè)步驟中起作用，他們的作用包括鏈間交聯(lián)（ICLs）的識(shí)別和剪切、跨損傷合成（TLS）以及介導(dǎo)同源重組修復(fù)（HRR）［11］。在復(fù)制的過程中，當(dāng)復(fù)制叉遇到DNA 交聯(lián)時(shí)，復(fù)制叉會(huì)停止，進(jìn)而使得FA 復(fù)合體募集到損傷位點(diǎn)。FA 復(fù)合體的1 個(gè)亞基FANCL 是1個(gè)E3 泛素連接酶，該酶可使FANCD2-FANCI 這個(gè)復(fù)合體發(fā)生單泛素化修飾，發(fā)生泛素化修飾之后就為后續(xù)的修復(fù)因子提供了1 個(gè)平臺(tái)［12］，而且FANCD2-FANCI 發(fā)生泛素化修飾之后可使自身更容易錨定到染色質(zhì)上并且與其他的一些修復(fù)因子結(jié)合到一起［13，14］，泛素化的FANCD2 會(huì)被核酸內(nèi)切酶FAN1 識(shí)別，進(jìn)而對(duì)發(fā)生交聯(lián)損傷的DNA 進(jìn)行剪切，從而保證受損的DNA 被切除，使得后續(xù)DNA 修復(fù)過程繼續(xù)，如同源重組（HR）和跨損傷修復(fù)（TLR）等修復(fù)方式得以進(jìn)行（圖3）。

圖3 泛素化修飾在DNA 交聯(lián)修復(fù)中的功能

3 泛素化修飾在核苷酸切除修復(fù)中的作用

當(dāng)細(xì)胞暴露在紫外線的照射下或其他一些化學(xué)藥物條件下時(shí)，DNA 會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體和環(huán)丁烷嘧啶二聚體這2 種常見損傷，此時(shí)DNA 損傷需要利用核苷酸切除修復(fù)（NER）損傷的DNA。核苷酸切除修復(fù)有2 種主要途徑：一種是全基因組范圍內(nèi)的修復(fù)，這種修復(fù)發(fā)生在整個(gè)基因組中；一種是轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的修復(fù)，這種修復(fù)方式主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的DNA模板鏈上［15］。

在全基因組堿基切除修復(fù)發(fā)生的過程中，UVDDB（與UV 引起損傷的DNA 結(jié)合非常緊密且特異性很高的結(jié)合因子）和XPC-RAD23（全基因組核苷酸切除修復(fù)所必須的識(shí)別因子）這2 個(gè)復(fù)合體會(huì)檢測到DNA 的損傷［10］。該過程首先是當(dāng)UV-DDB 復(fù)合體檢測到損傷時(shí)，它會(huì)募集XPC-RAD23 到損傷位點(diǎn)。而UV-DDB 這個(gè)復(fù)合體會(huì)與CUL4A∕B（一類疏水蛋白家族，可以為E3 泛素連接酶提供支架作用）這個(gè)蛋白質(zhì)形成1 個(gè)具有E3 泛素連接酶功能的復(fù)合體［15］，該復(fù)合體使組蛋白發(fā)生單泛素化的同時(shí)使DDB2 和XPC 發(fā)生多泛素化修飾［16］。研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線損傷DNA 時(shí)，泛素化的DDB2 并沒有結(jié)合DNA 的活性，而且DDB2 的泛素化修飾介導(dǎo)了DDB2 被蛋白酶體的降解［17］。而XPC 發(fā)生泛素化修飾后表現(xiàn)出與DNA 結(jié)合的活性，特別是當(dāng)DNA被紫外線損傷之后，結(jié)合活性表現(xiàn)出增加的情況，而且XPC 被RAD23（與蛋白酶體發(fā)生結(jié)合的蛋白）保護(hù)而不被降解［18］，同時(shí)被泛素化的XPC 在DNA損傷位點(diǎn)會(huì)募集TFIIH（轉(zhuǎn)錄因子2H，核苷酸切除修復(fù)因子之一）到損傷位點(diǎn)參與核苷酸切除修復(fù)（圖4）。

圖4 泛素化修飾在全基因組核苷酸切除修復(fù)中的功能

在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復(fù)發(fā)生過程中，首先是細(xì)胞會(huì)激活轉(zhuǎn)錄異常引起核苷酸切除修復(fù)反應(yīng)，接著會(huì)發(fā)生泛素化修飾、RNA 聚合酶2 的降解等事件。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復(fù)主要依賴于科凱恩綜合征蛋白B（CSB，與RNA 聚合酶2 結(jié)合的蛋白）。該蛋白除了在堿基切除修復(fù)中引起DNA 重塑之外，它還會(huì)募集科凱恩綜合征蛋白A（CSA）到損傷位點(diǎn)，接著這2 個(gè)蛋白和DDB1 與CUL4 一起組成1 個(gè)具有E3 泛素連接酶活性的復(fù)合體，該復(fù)合體形成后會(huì)使ATF3 發(fā)生泛素化修飾，ATF3 發(fā)生泛素化修飾之后，會(huì)被蛋白酶體降解，該過程會(huì)使RNA 聚合酶2 重新開始轉(zhuǎn)錄過程［19，20］。接著在后續(xù)招募的蛋白中，有部分蛋白是參與DNA 修復(fù)的關(guān)鍵因子，而其中1 個(gè)蛋白R(shí)sp5 是E3 泛素連接酶（哺乳動(dòng)物中是NEDD4），它會(huì)與Uba1（E1）、Ubc5（E2）一起介導(dǎo)RNA 聚合酶2 發(fā)生K-63 的泛素化從而導(dǎo)致其降解［21］，RNA 聚合酶2 降解之后轉(zhuǎn)錄終止，DNA 開始后續(xù)修復(fù)機(jī)制（圖5）。

圖5 泛素化修飾在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的堿基切除修復(fù)中的功能

另外，E3 泛素連接酶RNF8 也是一個(gè)在DNA損傷扮演著重要功能的蛋白。有研究指出，RNF8與Ube2S∕Ube2C 介導(dǎo)的組蛋白的K11 位泛素化修飾對(duì)于DNA 損傷修復(fù)很重要。該泛素化修飾同樣是在DNA 損傷發(fā)生后，對(duì)終止正在轉(zhuǎn)錄的RNA 聚合酶2 介導(dǎo)的RNA 轉(zhuǎn)錄是必須的［7］，這樣在DNA損傷位點(diǎn)，細(xì)胞就能將RNA 聚合酶2 從損傷位點(diǎn)解離下來，以便于DNA 損傷修復(fù)因子參與損傷DNA 的修復(fù)。

4 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)中的作用

DNA 雙鏈斷裂（DSB）是細(xì)胞內(nèi)最嚴(yán)重的DNA損傷，DNA 雙鏈斷裂有同源重組修復(fù)（HRR）和非同源性末端連接（NHEJ），同源重組修復(fù)（HRR）是一種精確的修復(fù)機(jī)制，而非同源性末端連接（NHEJ）則是一種易錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制。在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)過程中，當(dāng)細(xì)胞檢測到DNA 發(fā)生損傷時(shí)，組蛋白H2AX會(huì) 發(fā) 生 磷 酸 化 而 形 成γH2AX［22］，MDC1 會(huì) 識(shí) 別γH2AX 并被募集到損傷位點(diǎn)，當(dāng)MDC1 被募集到損傷位點(diǎn)時(shí)，ATM 將MDC1 磷酸化，磷酸化的MDC1會(huì)被E3 泛素連接酶RNF8 所識(shí)別［23］。接著E3 泛素連接酶RNF168 也被募集到該位點(diǎn)，當(dāng)RNF8 和RNF168 都被募集到損傷位點(diǎn)后，會(huì)引起H2A 發(fā)生K13∕K15 泛素化修飾，K13∕K15 泛素化修飾發(fā)生之后DNA 雙鏈斷裂修復(fù)的相關(guān)因子，如53BP1、RAD18、BRCA1、RAP80 復(fù)合體（也稱作BRCA1-A）以及EXPAND（EXPAND 在DNA 修復(fù)中的作用可使DNA 處于松散狀態(tài)）等因子會(huì)被募集到DNA 損傷位點(diǎn)［24］，當(dāng)53BP1 被募集到該位點(diǎn)并且被RAD18進(jìn)行泛素化修飾后，53BP1 與染色質(zhì)的結(jié)合更加緊密，有助于DNA 損傷的修復(fù)。緊接著這些因子會(huì)參與到DNA 損傷修復(fù)，而這些不同因子之間的相互作用會(huì)使細(xì)胞決定選擇使用非同源性末端連接（NHEJ）還是同源重組（HR）來進(jìn)行修復(fù)，如53BP1募集到DNA 損傷位點(diǎn)時(shí)會(huì)使細(xì)胞用非同源性末端連接（NHEJ）進(jìn)行修復(fù)，而當(dāng)BRCA1 募集到損傷位點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞會(huì)傾向于使用同源重組（HR）這條修復(fù)途徑（圖6）。

圖6 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)中的功能（一）

在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)過程中，除了RNF8 和RNF168 這2 個(gè)E3 泛素連接酶被募集到損傷位點(diǎn)之外，RNF20 和RNF40 這2 個(gè)蛋白也會(huì)以ATM 依賴的方式募集到DNA 損傷位點(diǎn)，RNF20 和RNF40會(huì) 引 起 組 蛋 白H2B 的K120 泛 素 化 修 飾［25］。當(dāng)RNF20 和RNF40 引起H2B 的K120 泛素化修飾之后，該修飾會(huì)促進(jìn)染色質(zhì)的解聚，從而為修復(fù)因子提供接近損傷染色質(zhì)的空間［26，27］，這些修復(fù)因子包含了參與同源重組修復(fù)（HRR）和非同源性末端連接（NHEJ）這2 種修復(fù)方式的修復(fù)因子［28］。在修復(fù)過程中，除了RNF20 和RNF40 會(huì)引起H2B K120 的泛素化修飾外，E3 泛素連接酶BMI1∕RING2 在DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)會(huì)依賴于NBS1（MRN 復(fù)合體中的蛋白之一）而被募集到損傷位點(diǎn)，該過程接著會(huì)引起H2A∕H2AX 的K119 泛 素 化 修 飾，H2A∕H2AX 的K119 泛素化修飾產(chǎn)生之后會(huì)使E3 泛素連接酶RNF168 更容易定位到損傷位點(diǎn)，但是RNF168 到該位點(diǎn)之后是否會(huì)對(duì)BMI1∕RING2 催化產(chǎn)生的泛素化修飾起加強(qiáng)作用并不清晰［29］，RNF168 會(huì)使組蛋白H2A 的13 位和15 位賴氨酸發(fā)生泛素化修飾，此外，RNF168 還會(huì)使H2A 發(fā)生K63 泛素化修飾，因此，當(dāng)RNF168 被募集到損傷位點(diǎn)之后會(huì)催化H2A產(chǎn)生K63 泛素化修飾，該修飾會(huì)幫助RAP80 也被募集到損傷位點(diǎn)，而RAP80 會(huì)幫助其他的DNA 損傷修復(fù)因子進(jìn)入損傷位點(diǎn)參與DNA 損傷修復(fù)［30］（圖7）。

此外，BRCA1 在同源重組（HR）修復(fù)途徑中會(huì)和BARD1 形成1 個(gè)異源二聚體來泛素化H2A 的127 位和129 位賴氨酸，K127∕129 的泛素化修飾會(huì)在同源重組修復(fù)過程中促進(jìn)損傷DNA 的末端進(jìn)行切割而形成黏性末端［31］，從而保證鏈侵入過程順利發(fā)生，使得損傷的DNA 能夠從姐妹染色單體上找到互補(bǔ)序列進(jìn)行修復(fù)。BRCA1 參與修復(fù)過程會(huì)受到許多機(jī)制的調(diào)節(jié)，Baranes-Bachar 等［32］研究中提到 了UBE4A 這 個(gè)E3∕E4 泛 素 連 接 酶，UBE4A 以53BP1 依賴的方式被募集到DNA 雙鏈斷裂的位點(diǎn)，接著使組蛋白發(fā)生K48 和K63 連接的泛素化修飾，緊接著RAP80 會(huì)被募集到發(fā)生K63 修飾的這個(gè)位點(diǎn)，之后它會(huì)募集BRCA1，從而組成BRCA1-A 復(fù)合體（包括BRCA1、RAP80、ABRAXAS 和MERIT40等蛋白）。UBE4A 也會(huì)幫助BRCA1-A 向BRCC 復(fù)合體（包括BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD51 等蛋白）轉(zhuǎn)化，當(dāng)BRCA1-A 轉(zhuǎn)化成BRCC 復(fù)合體之后，BRCC 復(fù)合體會(huì)促進(jìn)RAD51 在DNA 雙鏈斷裂位點(diǎn)的結(jié)合，從而使得同源重組修復(fù)繼續(xù)進(jìn)行［7］。

圖7 泛素化修飾在DNA 雙鏈斷裂修復(fù)中的功能（二）

5 小結(jié)與展望

DNA 作為細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，控制著細(xì)胞的每一個(gè)生理過程，同時(shí)DNA 也是細(xì)胞內(nèi)每個(gè)生理過程的基礎(chǔ)，如果DNA 發(fā)生損傷，對(duì)于細(xì)胞來說將是致命的。DNA 損傷會(huì)造成DNA 的突變，而產(chǎn)生的這些突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生癌癥等各種疾病。因而，準(zhǔn)確理解DNA 損傷以及DNA 損傷的修復(fù)機(jī)制對(duì)于相關(guān)疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義，目前通過靶向DNA 損傷相關(guān)蛋白來治療疾病的藥物已經(jīng)有部分得以應(yīng)用。而泛素化修飾在DNA 損傷修復(fù)過程中的作用暗示著許多泛素化修飾相關(guān)的蛋白可能是潛在的治療靶點(diǎn)，因此，對(duì)近幾十年來報(bào)道過的DNA 損傷修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用的泛素化修飾過程和相關(guān)蛋白進(jìn)行總結(jié)，可以為相關(guān)疾病的治療和基礎(chǔ)研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。