β2AR激動劑通過線粒體細胞凋亡途徑改善大鼠心肌缺血再灌注損傷

劉 通,史靜怡,王 利,閆泱錦,程 康,冀永春

(西安市第三醫(yī)院,西北大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710018;*通訊作者,E-mail:18629057123@163.com)

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)屬于冠心病的一種特殊類型,是指由冠狀動脈粥樣硬化而引起長期心肌缺血,導致患者心肌彌漫性纖維化,產(chǎn)生與原發(fā)性擴張型心肌病類似的臨床綜合征[1],其是嚴重危脅人類健康的主要疾病之一[2]。隨著冠心病發(fā)病率的不斷增加,ICM對人類健康所造成的危害也日漸嚴重。目前對其治療主要是及時有效的恢復血流,搶救“瀕死”的心肌[3]。但是,再灌注過程會對心肌造成一定的損傷,這種損傷被稱為心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R),該損傷因嚴重影響心肌梗死再灌注治療的效果而逐漸成為研究重點[4]。研究表明,細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用。細胞凋亡中3條主要途徑(線粒體、死亡受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中線粒體途徑為細胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來,通過調(diào)節(jié)線粒體通路抑制心肌細胞凋亡是研究心肌缺血損傷的一大重點[5]。β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptors,β2AR)在I/R中具有重要的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn),在心肌缺血時,過度激動β2AR,導致心臟氧耗增多,最終導致心肌細胞壞死,激動β1受體促進凋亡,而激動β2受體有抗凋亡作用[7]。Clenbuterol是選擇性β2受體激動劑,張秋芳等[8]發(fā)現(xiàn)在心梗后長期聯(lián)合應用β2腎上腺受體阻斷劑clenbuterol可提高生存率,對心肌細胞有保護作用。由此,我們推測clenbuterol可能通過激動β2受體對I/R損傷具有保護作用,且主要是通過線粒體細胞凋亡途徑發(fā)揮作用。因此本研究通過建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型在整體和細胞水平研究β2腎上腺素能受體激動劑(clenbuterol)對I/R中線粒體細胞凋亡途徑的影響,以期為冠心病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

戊巴比妥鈉(Sigma,USA),TTC(Sigma-Aldrich),RNA提取試劑盒(Invitrogen,USA)RT-PCR試劑盒(Fermetas),線粒體蛋白提取試劑盒(wla034a)、BCA蛋白定量試劑盒(wla004a),ELISA試劑盒(Sigma Aldrich),LDH和CK-MB(南京建成生物工程研究所),抗體AR-β2(Abcam)、Bax(Abcam)、Caspase-3(Abcam)、Cx43(Abcam)和PKC-ε(Abcam),電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1,VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗體(沈陽萬類,wl02790)。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型的制備與分組 45只體質(zhì)量為250-300 g的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所[SCXK(陜)2016-001],隨機分為假手術(shù)組、模型組和實驗組,每組15只。大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉后,進行氣管插管,調(diào)節(jié)呼吸頻率為90次/min,潮氣量11 ml/kg,連接心電監(jiān)護儀,于大鼠胸骨左側(cè)第3、4肋間做手術(shù)切口,暴露心臟,剝離心包膜,采用7-0帶線縫合針于左心耳下緣1 cm處穿過待結(jié)扎加壓。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎加壓,僅在假手術(shù)開始前通過腹腔注射給予生理鹽水(4 ml/kg);模型組大鼠在結(jié)扎前通過腹腔注射給予生理鹽水(4 ml/kg)并開始計時,觀察到心電圖ST段持續(xù)弓背抬高,確定心肌缺血成功,30 min后輕抽魚線再灌注3 h[9]。實驗組大鼠在結(jié)扎前5 min通過腹腔注射給予clenbuterol(0.5 mg/kg),后續(xù)處理同模型組。再灌注結(jié)束后收集大鼠心臟和血液,進行相關(guān)指標檢測。

1.2.2 指標觀察與組織學檢查 通過測量Ⅱ?qū)?lián)心電圖同步監(jiān)測所有組別大鼠結(jié)扎30 min后的心電圖表現(xiàn),并與術(shù)前心電圖比較,觀察大鼠心電圖有無再灌注心律失?，F(xiàn)象。取各組大鼠左室心尖部組織進行多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,再經(jīng)過二甲苯脫蠟,經(jīng)無水乙醇、95%乙醇和80%乙醇逐級漂洗,行蘇木素一伊紅(HE)染色,于光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠造模結(jié)束取血后迅速剪下心臟,以生理鹽水灌洗后在冰上分離左心室,取一小塊組織置入2.5%戊二醛固定液中,并在固定液中迅速將其剪為體積約1 mm3的小塊,經(jīng)過脫水、滲透、包埋聚合、切片等步驟,于透射電鏡下找到心肌細胞內(nèi)的線粒體進行觀察并拍照。

1.2.4 心肌酶檢測 造模結(jié)束后剪開頸部皮膚,分離頸靜脈并以一次性醫(yī)用取血管取血。血液靜置30 min后置入離心機,以3 000 r/min離心10 min,血清移入EP管中,應用全自動生化分析儀測定各組血清中肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。

1.2.5 RNA提取和RT-PCR檢測 通過Trizol法從大鼠心肌組織細胞中提取總RNA,然后將純化的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再通過RT-PCR試劑盒定量檢測β2AR的mRNA表達水平。使用Thermo Fisher的Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀器進行檢測,采用的軟件為Mx3000P,PCR程序為:95 ℃預熱10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃退火1 min,40個循環(huán)反應。引物序列:β2AR,F:5′-CAGCAAAGGGACGAGGTG-3′,R:5′-AAGTAATGGCAAAGTAGCG-3′;GAPDH,F:5′-CGTGCGTGACATTAAGGAG-3′,R:5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′。GAPDH作為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt方法檢測基因相對表達水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 用RIPA法從大鼠心肌組織細胞中提取總蛋白,以線粒體蛋白提取試劑盒提取線粒體蛋白,于4 ℃ 10 000g離心5 min。BCA測定法測量蛋白質(zhì)含量,用8%-12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品(50 μg),并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將膜用TBST中的5% BSA封閉,并與β2AR(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Cx43(1 ∶1 000)、PKC-ε(1 ∶500)和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗體(1 ∶1 000)第一抗體在4 ℃下孵育過夜,然后將膜用TBST洗滌,并與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)或HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體在37 ℃孵育1 h。使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑觀察蛋白質(zhì)條帶,并計算灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SPSS21.0分析數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差,兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗比較差異性,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析差異性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組大鼠心電圖變化

模型組大鼠結(jié)扎后,ST段顯著上移,T波增高,表現(xiàn)出心律失?，F(xiàn)象,而再灌注之后,ST段和T波與結(jié)扎時相比顯著下降,但與結(jié)扎前相比仍有增加(P<0.01,見表1),表明心肌缺血再灌注大鼠模型構(gòu)建成功。

表1 模型組大鼠心肌缺血再灌注前后心電圖的變化 (mV)

2.2 β2腎上腺素能受體激動劑對大鼠心肌組織的病理改變影響

HE染色結(jié)果表明,假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)無變化,皮質(zhì)神經(jīng)元顯示正常結(jié)構(gòu);模型組大鼠核固縮,核周體顯著增加,出現(xiàn)眾多的空泡空間;與模型組相比,實驗組心肌細胞壞死明顯減少,心肌纖維可見輕度水腫,可見核的殘留神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)得到改善(見圖1)。

2.3 大鼠心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡下可見,假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元和細胞器的外觀形態(tài)正常,線粒體形態(tài)和大小正常;模型組大鼠線粒體腫脹、變形嚴重,膜結(jié)構(gòu)模糊;實驗組大鼠膜結(jié)構(gòu)模糊,線粒體略有腫脹,神經(jīng)元損傷較輕(見圖2)。該結(jié)果提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol可以有效減輕大鼠心肌缺血再灌注造成的線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷。

2.4 大鼠心肌組織中β2AR的表達

與模型組相比,實驗組大鼠心肌組織中β2AR的mRNA和蛋白相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05,見圖3)。表明β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠激活β2AR的表達。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 (×200)Figure 1 HE staining results of rat myocardial tissue (×200)

圖2 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌缺血再灌注后線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 (×2 000)Figure 2 Effect of clenbuterol on ultrastructure of mitochondria after myocardial ischemia-reperfusion injury in rats (×2 000)

A.各組大鼠中β2AR mRNA的相對表達水平 B.各組大鼠中β2AR蛋白的相對表達水平與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖3 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌組織中β2AR的mRNA和蛋白表達的影響Figure 3 Effect of clenbuterol on β2AR mRNA and protein expression in myocardial tissues in each group

2.5 大鼠血清中心肌酶檢測分析

與假手術(shù)組比較,模型組和實驗組大鼠血清中CK-MB和LDH含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠血清中CK-MB和LDH含量顯著降低(P<0.05,見圖4)。提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能顯著降低大鼠心肌缺血再灌注導致的急性心肌損傷。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖4 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌缺血再灌注后血清中心肌酶水平的影響Figure 4 Effect of clenbuterol on serum myocardial enzyme level after myocardial ischemia-reperfusion in rats

2.6 大鼠心肌細胞凋亡因子與線粒體蛋白表達分析

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05,見圖5)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中Cx43和PKC-ε蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,實驗組大鼠心肌組織中Cx43和PKC-ε蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05,見圖5)。提示β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol在大鼠心肌缺血再灌注過程中可能通過上調(diào)Cx43和PKC-ε蛋白表達而抑制線粒體細胞的凋亡。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖5 腎上腺素能受體激動劑clenbuterol對大鼠心肌細胞凋亡因子與線粒體蛋白表達的影響Figure 5 Effect of clenbuterol on the expression levels of rat cardiomyocyte apoptosis factors and mitochondrial proteins

3 討論

心肌缺血對心肌產(chǎn)生一定損傷,目前常見的治療方式為再灌注,但是再灌注過程可進一步加重心肌的損傷,從而引起一系列病癥[10],因此通過不同治療緩解損傷是目前研究的重點。而相關(guān)研究主要是通過建立大鼠缺血再灌損傷模型實現(xiàn),主要是由于具有大鼠冠狀動脈分支少、用于制備缺血再灌損傷模型復制性好、模型成功率高等優(yōu)勢[11]。本實驗構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol可明顯降低心肌缺血損傷癥狀,且發(fā)現(xiàn)這種治療作用上調(diào)了β2AR基因表達,緩解了線粒體損傷以及調(diào)控線粒體內(nèi)蛋白Cx43、PKC-ε以及細胞凋亡因子Caspase-3和Bax的表達,因此推測clenbuterol治療作用可能主要是通過抑制線粒體細胞凋亡實現(xiàn)。

LDH和CK-MB是細胞損傷程度的標志[12],其存在于心肌細胞內(nèi),只有當細胞膜受損,通透性發(fā)生改變時才會出現(xiàn)外漏,所以通常檢測和來評價細胞損傷的程度[13]。本實驗結(jié)果表明,clenbuterol可降低心肌缺血再灌后造成的心肌損傷,即與模型組相比,clenbuterol治療可顯著降低大鼠血清中LDH和CK-MB的釋放量,這說明clenbuterol對缺血再灌注后的心肌細胞有保護作用,這與前人的報道一致[8]。

心肌細胞在缺血缺氧條件下會發(fā)生線粒體功能障礙[14]、線粒體內(nèi)的細胞色素C釋放進入胞質(zhì)并啟動線粒體凋亡途徑[15]。本研究通過透射電鏡觀察各組中線粒體情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),clenbuterol能緩解線粒體損傷,這與前人結(jié)果一致。Bax是線粒體膜上調(diào)節(jié)細胞色素C通透性的分子[16],其主要通過增加細胞色素C的釋放并起到促凋亡作用[17],進入胞質(zhì)的細胞色素C通過級聯(lián)反應來激活Caspase-3并引起細胞凋亡[18],本實驗中,模型組中Bax和Caspase-3的表達水平均明顯高于假手術(shù)組,提示心肌缺血再灌注能夠?qū)е滦募〖毎木€粒體凋亡途徑發(fā)生激活。而實驗組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3的表達水平均明顯低于模型組。另外,研究表明,線粒體Cx43及PKC-ε在調(diào)節(jié)心肌細胞內(nèi)ATP敏感性鉀通道及MitoKATP通道中起著重要作用[19],其中MitoKATP通道在干預心肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[20],因此,本實驗檢測了線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白的表達量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),clenbuterol顯著上調(diào)了線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白的表達量,表明β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠抑制心肌缺血再灌注引起的心肌細胞線粒體途徑凋亡。

綜上所述,β2腎上腺素能受體激動劑clenbuterol能夠減輕心肌缺血再灌注誘導的心肌細胞損害、抑制再灌注誘導的心肌細胞線粒體途徑凋亡,且這種抑制主要是通過上調(diào)線粒體中Cx43及PKC-ε蛋白以及抑制細胞凋亡因子Bax和Caspase-3的表達來發(fā)揮作用。