高效液相色譜法測定鮭降鈣素中醋酸含量的不確定度的評定

李蘭蘭，李坦城，胡光華，孫麗艷，張紅丹

（長春市食品藥品檢驗中心，吉林 長春 130000）

不確定度作為衡量測定質(zhì)量的標(biāo)志，為檢測結(jié)果的比較帶來很大方便。目前不確定度概念已經(jīng)深入各行各業(yè)，在科研、制標(biāo)、實驗室認(rèn)可等方面發(fā)揮著重要作用。本文以高效液相法測定鮭降鈣素中醋酸含量為例，探討了該方法不確定度的來源、評定、合成及結(jié)果的表述，建立了該方法的數(shù)學(xué)模型。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀；XA205電子天平、S-210酸度計（梅特勒公司）。玻璃量器均已檢定。甲醇（色譜純），磷酸、氫氧化鈉（分析純），實驗用水為一級水。

冰醋酸購自天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)開發(fā)有限公司。鮭降鈣素，批號：SG649901，購自酷爾生物。

1.2 實驗方法

《中國藥典》2015年版二部，高效液相色譜法測定鮭降鈣素中醋酸含量。

1.2.1 樣品處理

對照品溶液：精密稱取冰醋酸對照品250mg，置25ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml至50ml量瓶中，用流動相定量稀釋至刻度，即得。

供試品溶液：精密稱取本品8mg，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 測定方法

實驗條件：

流動相：流動相A：磷酸溶液（在1000ml水中加磷酸0.7ml，用0.42%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0）流動相B：甲醇，進(jìn)行梯度洗脫：

0-5min：95%A，5%B；5-10min：50%A，50%B；20-30 min：95%A，5%B；

色譜柱：InertSustain C18 5μm 4.6×250mm,S/N4AR98020

流速：1.2ml/min；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl

2 數(shù)學(xué)模型

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度來源

（1）對照品制備：稱量過程u(m)、對照品純度u(p)、定容過程u(v1)，稀釋過程u(v2)；

（2）供試品制備：稱量過程u(m)、樣品純度u(p)。

3.2 各不確定度分量

3.2.1 對照品制備引入的不確定度

3.2.1.1 稱量過程

試驗中天平置信區(qū)間為0.01mg，按均勻分布：

稱量兩次，天平引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

稱量醋酸天平的相對不確定度：

稱量鮭降鈣素天平的相對不確定度：

3.2.1.2 對照品純度

醋酸對照品說明書未提供不確定度，在此不參加計算。

3.2.1.3 定容過程

①JJG196-1990規(guī)定，20℃時25ml A級容量瓶容量允差為0.030ml，，取三角形分布：

②溫度

實驗溫差以3℃計，用流動相定容。

有機(jī)溶劑的膨脹系數(shù)=1×10-3水膨脹系數(shù)= 2.1×10-43℃差異 P = 0.95時 C = 1.96

定容醋酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對不確定度：

3.2.1.4 稀釋過程

（1）5ml移液管帶來不確定度

①JJG196-1990規(guī)定，20℃時5mL A級移液管容量允差為0.020ml，取三角形分布： u (V5ml1)==0.008167ml

②溫度

參考3.1.1.3②

u (V5ml2)= 0.001909ml

5ml移液管引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度：

5ml移液管引起的相對不確定度：

由稀釋引起的相對不確定度：

3.2.1.5 定容過程

①JJG196-1990規(guī)定，20℃時50mL A級容量瓶容量允差為0.050ml，取三角形分布：

②溫度

參考3.1.1.3②u (V定2)= 0.01909ml

由定容醋酸對照品引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度：

相對不確定度：

對照品制備過程引入的相對不確定度：

3.3 供試品制備的不確定度

3.3.1 10ml容量瓶帶來的不確定度

①JJG196-1990規(guī)定，20℃時10mL A級容量瓶的容量允差為0.020ml，取三角形分布：

②溫度

公式條件同3.1.1.3②

u (V)= 0.003818

10ml容量瓶引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度：

供試品制備過程引起的相對不確定度：

3.4 液相色譜儀的不確定度

計量檢定證書給出RSD為0.06% ，對照品和樣品峰面積相對不確定度為：

3.5 結(jié)果的重復(fù)性引入的不確定度

日常檢測采用標(biāo)準(zhǔn)化殘差標(biāo)準(zhǔn)差。4組原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化殘差為0.0152，兩次測量平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.6 合成相對不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

7.0 %×0.01105 = 0.08%

3.7 擴(kuò)展不確定度

U = Ku （K=2）

= 0.08% ×2 ≈ 0.2%

3.8 報告結(jié)果

C = （ 7.0%±0.2% ） （k=2）

當(dāng)置信概率為95%時，分散區(qū)間為（ 7.0%±0.2% ）

4 結(jié)果討論

整個實驗過程需充分考慮各影響因素對不確定度的影響。其中主要因素來源于重復(fù)測量，對照品及供試品制備過程，在實驗過程中，應(yīng)控制好影響較大的因素。對照品和樣品的純度不確定度也會影響結(jié)果，由于所用對照品和樣品均未提供純度，忽略其對本次實驗結(jié)果的影響。在實驗過程中，溫度變化帶來的不確定度不容忽視，實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)測環(huán)境溫度變化。