轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR10在布魯氏菌感染細(xì)胞和小鼠模型中的毒力作用研究

李志強(qiáng),王書利,席麗,崔艷艷,張春梅,施傳信,張輝

(1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院,河南 商丘 476000；2.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000)

布魯氏菌(Brucella)是革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌,可以在人和動(dòng)物的專業(yè)和非專業(yè)吞噬細(xì)胞內(nèi)生存,引起人和多種動(dòng)物發(fā)生疾病[1].在布魯氏菌的菌屬中,羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌和牛種布魯氏菌可以感染人,引起人類布魯氏菌病[2].牛種布魯氏菌是牛布魯氏菌病的病原體,分布廣泛,可引起牛的流產(chǎn)和人慢性感染性疾病,特別是在發(fā)展中國(guó)家可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失.疫苗免疫是有效控制牛感染本病的途徑.目前,S19和RB51減毒活疫苗已經(jīng)被廣泛用于牛布魯氏菌病的預(yù)防.然而,如果將這些疫苗用于懷孕動(dòng)物,可能會(huì)引起流產(chǎn).因此,這些疫苗對(duì)于動(dòng)物而言存在一定毒力,限制了其使用.為了解決這些問題,采用相關(guān)毒力基因缺失技術(shù)改善現(xiàn)有疫苗.

GntR家族是一類非常重要的毒力調(diào)控子,廣泛分布在病原菌中,它們調(diào)控細(xì)菌的許多生物過程.GntR調(diào)控子包含從GntR1至GntR20毒力因子.質(zhì)粒標(biāo)記誘變技術(shù)顯示羊種布魯氏菌16MΔgntR10突變株在小鼠體內(nèi)是減毒的.因此,GntR10在布魯氏菌致病過程中扮演重要角色.本研究用2308ΔgntR10突變株感染上皮細(xì)胞系(HPT-8)、小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)和小鼠模型(BALB/c),目的是探索牛種布魯氏菌2308(S2308)在細(xì)胞和小鼠模型中的胞內(nèi)存活作用,揭示GntR10在細(xì)胞和小鼠感染過程中調(diào)節(jié)布魯氏菌毒力的可能機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

布魯氏菌S2308、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為本研究室保存；自殺載體pGEM-7Zf+購(gòu)自Promega公司；pMD19-T Simple克隆載體購(gòu)自Takara公司；本研究所用引物及其序列見表1.

表1 本研究所用的引物

1.1.2 細(xì)胞

上皮細(xì)胞系(HPT-8)和巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心.

1.1.3 小鼠

4-6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自烏魯木齊疾病預(yù)防控制中心.

1.1.4 主要試劑

2×Es Taq MasterMix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子量Maker、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司；限制性核酸內(nèi)切酶(Sph I、Xho I、BamH I)、T4 DNA連接酶購(gòu)自Takara公司；氨芐霉素購(gòu)自Solarbio公司；慶大霉素購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM高糖、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司.

1.1.5 培養(yǎng)基

布魯氏菌液體培養(yǎng)基(TSB)和布魯氏菌固體培養(yǎng)基(TSA)購(gòu)自美國(guó)BD公司；布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基(BMB)、蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂粉購(gòu)自日本Biosharp公司；氯化鈉購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 2308ΔgntR10突變株的構(gòu)建

按照已公布的方法構(gòu)建2308ΔgntR10突變株.以S2308基因組為模版,用GntR10-N-F和GntR10-N-R引物(表1)擴(kuò)增gntR10基因的上游同源臂(957 bp).用GntR10-C-F和GntR10-C-R引物(表1)擴(kuò)增gntR10基因的下游同源臂(876 bp).通過SphⅠ、XhoⅠ和BamHI位點(diǎn)連接至pGEM-7Zf+載體,獲得重組質(zhì)粒pGEM-7Zf+-gntR10.以B.subtilis為模板,用SacB-F和SacB-R引物(表1)擴(kuò)增標(biāo)記基因SacB(1500 bp).通過BamHI-BamHI位點(diǎn),亞克隆至pGEM-7Zf+-gntR10載體,獲得自殺質(zhì)粒pGEM-7Zf+-gntR10-SacB.將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至S2308感受態(tài)細(xì)胞,涂布TSA平板(含100 μg/mL氨芐霉素),進(jìn)行初次篩選.將初次篩選的細(xì)菌,涂布TSA平板(含5%蔗糖),進(jìn)行第二次篩選.按照公布的方法,對(duì)第二次篩選到的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定.以篩選到的細(xì)菌為模板,用GntR10-F和GntR10-R引物(表1)進(jìn)行鑒定,將鑒定正確的菌株命名為2308ΔgntR10.

1.2.2 互補(bǔ)株的構(gòu)建

按照已公布的方法構(gòu)建2308ΔgntR10突變株的互補(bǔ)株[7].以S2308基因組為模板,用GntR10-N-F和GntR10-C-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增到的片段連接至pMD19-T Simple載體,獲得質(zhì)粒GntR10-T.將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至2308ΔgntR10突變株內(nèi),電轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物涂布TSA平板(含100 μg/mL氨芐霉素).以GntR10-F和GntR10-R為引物,對(duì)互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C進(jìn)行RT-PCR鑒定,進(jìn)一步證實(shí)gntR10基因在互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C中轉(zhuǎn)錄恢復(fù).

1.2.3 2308ΔgntR10在細(xì)胞模型中的毒力檢測(cè)

按照已公布的方法,測(cè)定細(xì)菌在細(xì)胞模型中的毒力[8].將上皮細(xì)胞系HPT-8和巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)至6孔板內(nèi),細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)至單層(約1 × 105個(gè)/孔).隨后用2308ΔgntR10、2308ΔgntR10-C和S2308以100∶1的感染復(fù)數(shù)(MOI=100)侵染細(xì)胞,侵染后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi).侵染45 min后,細(xì)胞用新鮮DMEM培養(yǎng)液漂洗三次,隨后加入含50 μg/mL慶大霉素的DMEM,孵育1 h,殺死胞外菌.1 h后棄去培養(yǎng)液,加入新鮮的含25 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液(此時(shí)定義為0 h).在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h),取出細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,用PBS漂洗三次,隨后加入1 mL含0.1%曲拉通的PBS裂解細(xì)胞,將裂解物10倍梯度稀釋后,選擇合適的稀釋度涂布TSA平板,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行CFU計(jì)數(shù).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次3個(gè)平行.

1.2.4 2308ΔgntR10在小鼠模型中的毒力檢測(cè)

按照已公布的方法,測(cè)定細(xì)菌在小鼠模型中的毒力[9].4-6周齡雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分成4組,分別腹腔注射200 μL 含1×106CFU的2308ΔgntR10、2308ΔgntR10-C和S2308的PBS,陰性對(duì)照組注射200 μL PBS.細(xì)菌的毒力通過測(cè)定感染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌在小鼠脾臟中的數(shù)量進(jìn)行確定.感染后第2、4、6和8周,各組分別處死小鼠(每組每個(gè)時(shí)間5只),無菌分離脾臟.脾臟用1 mL含0.1%曲拉通的PBS進(jìn)行研磨,裂解脾細(xì)胞,將裂解物10倍梯度稀釋后,選擇合適的稀釋度涂布TSA平板,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行CFU計(jì)數(shù).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次3個(gè)平行.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)菌在細(xì)胞和小鼠模型內(nèi)的存活能力用Log CFU平均值±SD表示.用SPSS 17.0分析突變株與親本株之間的差異性,當(dāng)P值< 0.05時(shí),差異顯著；P值< 0.01時(shí),差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 2308ΔgntR10突變株和2308ΔgntR10-C互補(bǔ)株的構(gòu)建

用GntR10-F和GntR10-R引物,可在S2308中擴(kuò)增到735 bp大小的DNA片段,但是用相同的引物,在2308ΔgntR10中卻沒有擴(kuò)增到任何片段,表明gntR10基因被敲除(圖1A).此外,RT-PCR結(jié)果顯示,gntR10基因在2308ΔgntR10中沒有轉(zhuǎn)錄,但是在互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C內(nèi)卻發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,表明2308ΔgntR10-C互補(bǔ)株構(gòu)建成功(圖1B).

2.2 2308ΔgntR10在HPT-8細(xì)胞中是減毒的

布魯氏菌侵染HPT-8細(xì)胞0 h后,各組的細(xì)菌進(jìn)入胞內(nèi)的數(shù)量沒有差異(圖2).侵染4 h后,HPT-8細(xì)胞對(duì)各組細(xì)菌的載菌量幾乎相等,表明各組細(xì)菌對(duì)HPT-8細(xì)胞的黏附侵襲能力沒有顯著差異(圖2).侵染后8 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到HPT-8細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降0.79-log(P> 0.05)和0.59-log(P> 0.05)(圖2).侵染后12 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到HPT-8細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降1.08-log(P> 0.05)和0.97-log(P> 0.05)(圖2).侵染后24 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到HPT-8細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降1.45-log(P> 0.05)和1.40-log(P> 0.05)(圖2).侵染后48 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到HPT-8細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降1.73-log(P< 0.05)和1.54-log(P< 0.05)(圖2).結(jié)果顯示,與S2308相比,2308ΔgntR10突變株在HPT-8細(xì)胞中限制了細(xì)菌的繁殖能力,表明2308ΔgntR10突變株在HPT-8細(xì)胞內(nèi)是減毒的.

圖1 2308ΔgntR10 and 2308ΔgntR10-C的鑒定

圖2 2308ΔgntR10在HPT-8細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)生存能力

2.3 2308ΔgntR10在RAW 264.7細(xì)胞中是減毒的

布魯氏菌侵染RAW 264.7巨噬細(xì)胞0 h后,各組的細(xì)菌進(jìn)入胞內(nèi)的數(shù)量沒有差異(圖3).侵染4 h后,RAW 264.7巨噬細(xì)胞對(duì)各組細(xì)菌的載菌量幾乎相等,表明各組細(xì)菌對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的黏附侵襲能力沒有顯著差異(圖3).然而,侵染后8 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降2.06-log(P< 0.01)和1.84-log(P< 0.01)(圖3).侵染后12 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降2.78-log(P< 0.01)和2.69-log(P< 0.01)(圖3).侵染后24 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降4.02-log(P< 0.01)和3.90-log(P< 0.01)(圖3).侵染后48 h,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降4.41-log(P< 0.01)和4.29-log(P< 0.01)(圖3).結(jié)果顯示,與S2308相比,2308ΔgntR10突變株在RAW 264.7細(xì)胞中限制了細(xì)菌的繁殖能力,表明2308ΔgntR10突變株在RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)是減毒的.

2.4 2308ΔgntR10在BALB/c小鼠中是減毒的

布魯氏菌感染BALB/c小鼠2周后,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到BALB/c小鼠脾臟內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降1.52-log(P< 0.01)和1.44-log(P< 0.01)(圖4).感染BALB/c小鼠4周后,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到BALB/c小鼠脾臟內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降2.47-log(P< 0.01)和2.31-log(P< 0.01)(圖4).感染BALB/c小鼠6周后,2308ΔgntR10突變株進(jìn)入到BALB/c小鼠脾臟內(nèi)的數(shù)量分別比親本株S2308和互補(bǔ)株2308ΔgntR10-C下降2.76-log(P< 0.01)和2.63-log(P< 0.01)(圖4).然而,感染BALB/c小鼠8周后,從BALB/c小鼠脾臟內(nèi)僅分離到0.43-log的2308ΔgntR10突變株,分離到3.72-log的S2308,分離到3.68-log的2308ΔgntR10-C(圖4).結(jié)果表明,2308ΔgntR10突變株在BALB/c小鼠體內(nèi)的存活能力是降低的.

圖3 2308ΔgntR10在RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)生存能力

圖4 2308ΔgntR10感染BALB/c小鼠后在脾臟內(nèi)的清除能力

3 討 論

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子gntR10是一個(gè)重要的毒力基因,它屬于布魯氏菌GntR家族的成員.已有研究報(bào)道,布魯氏菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR在控制其毒力方面扮演重要角色.布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌.它可以在專業(yè)吞噬細(xì)胞如RAW 264.7巨噬細(xì)胞中生存和繁殖,也可以在非專業(yè)吞噬細(xì)胞如滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)內(nèi)生存.因此,我們?yōu)榱舜_定2308ΔgntR10突變株在布魯氏菌中的影響,用2308ΔgntR10突變株分別侵染滋養(yǎng)層細(xì)胞HPT-8和小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7.結(jié)果發(fā)現(xiàn),2308ΔgntR10突變株在滋養(yǎng)層細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力顯著降低.結(jié)果表明,2308ΔgntR10突變株在細(xì)胞模型中是減毒的.

我們的前期研究證實(shí)了一些布魯氏菌在小鼠體內(nèi)存活相關(guān)的毒力基因[9].為了檢測(cè)2308ΔgntR10突變株的毒力,本研究通過檢測(cè)2308ΔgntR10突變株在BALB/c小鼠體內(nèi)的持續(xù)存在性,進(jìn)一步證實(shí)gntR10基因與布魯氏菌的毒力有關(guān).在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)2308ΔgntR10突變株在BALB/c小鼠體內(nèi)的毒力是顯著降低的.結(jié)果表明,布魯氏菌gntR10基因的缺失,導(dǎo)致布魯氏菌在BALB/c小鼠體內(nèi)的生存能力下降.

在本研究中,我們用自殺質(zhì)粒,構(gòu)建了2308ΔgntR10突變株,發(fā)現(xiàn)該突變株在HPT-8滋養(yǎng)層細(xì)胞和RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活時(shí)間是縮短的.此外,該突變株在BALB/c小鼠體內(nèi)的毒力也是顯著下降的.然而,2308ΔgntR10突變株能否作為潛在的新型疫苗仍需進(jìn)一步研究.