基于模擬胃腸道消化的云南民族乳制品蛋白肽研究

魏光強(qiáng)，施婭楠，萬(wàn)長(zhǎng)江，黃艾祥,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程學(xué)院，云南 大理 671003）

乳扇是云南大理、洱源地區(qū)白族人民食用的一種歷史悠久、民族特色濃郁的傳統(tǒng)乳制品，早在1563年明朝楊升庵所編著的《南詔野史》中就有記載，屬酸凝拉伸型干酪，是將酸木瓜熬制的酸漿或經(jīng)發(fā)酵后的酸乳清加熱后，倒入牛奶使酪蛋白酸凝拉伸而成[1]，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)34%。乳餅是滇中彝族、路南撒尼族地區(qū)的一種傳統(tǒng)山羊乳制品，距今已有600多年的歷史，其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，利用乳蛋白遇酸發(fā)生凝聚沉淀的原理制得，然后排乳清在模具里壓制成型，屬加熱酸凝新鮮干酪[2-3]，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%。奶渣是迪慶中甸地區(qū)藏族加工的一種傳統(tǒng)乳制品，由羊奶或牛奶提取酥油后的奶水經(jīng)微生物自然發(fā)酵劑發(fā)酵成熟后加工而成[4]。

現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道中的酶作用后大多以寡肽的形式被消化吸收，從而提供人體生長(zhǎng)、發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且機(jī)體對(duì)寡肽（二肽、三肽）的吸收代謝速度比對(duì)游離氨基酸快[5-6]。此外，寡肽具有多種生理功能，如抗高血壓[7]、抗血栓[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抑菌作用[10]等。體外消化模型是依據(jù)人體胃腸道消化液的主要成分及消化環(huán)境，在體外建立模擬消化體系，可用于食品生物利用度及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等的評(píng)價(jià)。Basilicata等[11]對(duì)水牛奶的6 種乳制品（酸奶、冰淇淋和4 種奶酪產(chǎn)品）進(jìn)行了模擬胃腸道消化肽譜鑒定，發(fā)現(xiàn)一些潛在的生物活性肽；Fontenele等[12]對(duì)巴西的Coalho奶酪進(jìn)行模擬胃腸道消化研究，鑒定了116 種不同的消化肽，發(fā)現(xiàn)一些源于β-和αs1-酪蛋白的潛在生物活性肽；Liu Yufang等[13]監(jiān)測(cè)了開菲爾羊乳在口腔，胃和小腸消化模型中肽譜的變化，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索注釋到16 種生物活性肽；Paolella等[14]對(duì)干腌巴馬火腿模擬胃腸道消化后釋放的肽進(jìn)行了鑒定，鑒定出多達(dá)81 種源于肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的肽序列，分子質(zhì)量主要在200～1 700 Da之間，一些已鑒定出具有潛在生物活性；Yu Yang等[15]對(duì)鹿茸蛋白進(jìn)行模擬胃腸道消化肽譜鑒定和體外生物活性研究，從消化液中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)被證明是DPP-IV（二肽基肽酶）和PEP（脯氨酰內(nèi)切酶）的抑制肽，對(duì)降低血糖和改善記憶力有一定的作用。綜上所述，蛋白在消化過(guò)程中能釋放一些具有生物活性的多肽。

云南的傳統(tǒng)民族乳制品乳扇、乳餅、奶渣屬高蛋白乳制品，是生物活性肽的重要來(lái)源。目前對(duì)乳扇、乳餅、奶渣的模擬胃腸道消化肽譜和生物活性的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以云南的民族乳制品乳扇、乳餅、奶渣為研究對(duì)象，基于體外消化模型、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和氨基酸分析研究3 種民族乳制品模擬胃腸道消化肽譜及游離氨基酸含量，并借助蛋白肽數(shù)據(jù)庫(kù)分析潛在的生物活性。以期為乳扇、乳餅、奶渣胃腸道蛋白水解物中蛋白活性肽的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳扇購(gòu)自云南省大理州；乳餅購(gòu)自云南省石林縣；奶渣購(gòu)自云南省迪慶州。

胃蛋白酶（695 U/mg）、胰蛋白酶（8×USP）、胰凝乳蛋白酶（1 500 U/mg）、膽汁鹽 美國(guó)Sigma公司；甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)默克公司；三氯乙酸（分析純） 天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；ZQLY-180S振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；30氨基酸自動(dòng)分析儀 英國(guó)Biochrom公司；Q Exactive四極桿質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1000液相色譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 云南民族乳制品加工工藝流程

乳扇：酸乳清（pH 2.9～3.2）→加熱（65～70 ℃）→添加牛奶（調(diào)整pH值至4.8）→凝乳→熱燙拉伸成型→晾曬→成品。

乳餅：羊奶→加熱殺菌（85～90 ℃）→添加酸乳清（酸乳清pH 2.9～3.2，調(diào)整pH值至4.8）→攪拌→凝塊→過(guò)濾→壓制成型→成品。

奶渣：牦牛奶→提取酥油→脫脂乳→加熱殺菌→加酸乳清自然發(fā)酵→排乳清→堆碼成型→奶渣。

1.3.2 樣品前處理

樣品脫脂：將樣品切割為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，然后與蒸餾水按質(zhì)量比1∶15進(jìn)行混合，勻漿（10 000 r/min，20 min），勻漿液經(jīng)離心（9 000×g，20 min），除去上浮脂肪，取上清液和底部酪蛋白，冷凍干燥（5～10 MPa、－50 ℃）得到凍干粉，－20 ℃保存，備用。

1.3.3 乳扇、乳餅、奶渣模擬胃腸道消化

參照Carriotti[16]和Monsoor[17]等的方法略作修改。模擬胃消化：準(zhǔn)確稱取1 g乳扇、乳餅、奶渣凍干粉溶解于20 mL去離子水中，并用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2，然后加入胃蛋白酶（酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100），在37 ℃條件下振蕩消化2 h，消化結(jié)束后通過(guò)在95 ℃下加熱溶液15 min進(jìn)行滅酶處理。模擬胰消化：將滅酶后的胃消化物用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，然后加入胰酶，胰凝乳蛋白酶和膽汁鹽，在37 ℃條件下振蕩消化2 h，然后在沸水中加熱15 min終止反應(yīng)。最后將混合物于4 ℃、4 000×g離心10 min，取出上清液，用10 kDa的濾膜超濾，冷凍干燥（5～10 MPa、－50 ℃）得到凍干粉，－20 ℃保存，備用。

1.3.4 乳扇、乳餅、奶渣游離氨基酸含量測(cè)定

參照張微等[18]的方法，分別準(zhǔn)確稱取各樣品（凍干粉）0.04 g，置于10 mL試管中，加1 mL水使溶解，并分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液5 mL，于漩渦混合儀上混合5 min，靜置10 min后4 000×g離心40 min，將上清液全部轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴蒸干。用衍生緩沖液多次洗滌蒸發(fā)皿，將洗滌液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，并用衍生緩沖液稀釋至刻度，混勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用氨基酸分析儀測(cè)定樣品游離氨基酸組成。

1.3.5 LC-MS/MS鑒定乳扇、乳餅、奶渣蛋白肽

將要分析的凍干樣品溶于體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液中，－20 ℃保存待用。色譜分析條件：A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為含0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)為84%）。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣至Trap柱。0.5 H梯度。質(zhì)譜分析條件：毛細(xì)管溫度為200 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV，歸一化碰撞能量為35.0%，一級(jí)掃描范圍400～4 000 Da。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2scan）。質(zhì)譜測(cè)試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

1.3.6 乳扇、乳餅、奶渣蛋白肽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

Xcalibur采集的*.RAW文件用Proteome Discoverer Daemon（v1.4）轉(zhuǎn)換成*.MGF格式，之后用Mascot 2.2軟件在牛（bovine）、羊（capra）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索參數(shù)如下：不設(shè)置酶切、最大漏切數(shù)和固定修飾，可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸的氧化（+15.994 9 D）。母離子的質(zhì)量容忍偏差為20×10－6，碎片離子為0.1 Da。導(dǎo)出肽段時(shí)設(shè)置Score≥20，P＜0.01，顯著性差異，同時(shí)控制假陽(yáng)性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜1%。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）和EROP-Moscow（http∶//erop.inbi.ras.ru/）檢索，評(píng)估3 種傳統(tǒng)乳制品消化產(chǎn)物中蛋白肽的潛在生物活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin Pro 2018軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳扇、乳餅、奶渣的消化產(chǎn)物蛋白肽

2.1.1 基于LC-MS/MS的消化產(chǎn)物肽譜

乳扇、乳餅、奶渣按照1.3.3節(jié)處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析，基峰色譜圖分別如圖1A、B、C所示。3 種乳制品的基峰譜圖存在一定的差異，乳扇的絕大多數(shù)高豐度的峰出現(xiàn)在16～24 min；乳餅峰出現(xiàn)在18～28 min；而奶渣峰出現(xiàn)在16～28 min。

2.1.2 3 種民族乳制品消化肽分子質(zhì)量分布

乳扇、乳餅和奶渣的消化產(chǎn)物經(jīng)LC-MS/MS進(jìn)行肽段序列解析，之后進(jìn)行蛋白肽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分別得到221、225 條和220 條蛋白肽，圖2呈現(xiàn)了3 種乳制品消化產(chǎn)物中蛋白肽分子質(zhì)量分布情況。3 種乳制品消化肽分子質(zhì)量在500～3 500 Da之間，由于LC-MS/MS對(duì)肽的檢測(cè)范圍為質(zhì)荷比400～4 000 Da，對(duì)于太大、太小或信號(hào)強(qiáng)度太低的肽段均檢測(cè)不到。乳扇中分子質(zhì)量在750～1 000 Da之間的蛋白肽占比最多，占所有多肽的36.2%，其次為500～750 Da的蛋白肽，占31.7%；而乳餅和奶渣中分子質(zhì)量在500～750 Da之間的蛋白肽占比最多，分別占30.7%和35.0%，其次為500～750 Da的蛋白肽，分別占25.85%和33.0%。分子質(zhì)量分布能夠體現(xiàn)蛋白水解、肽鍵斷裂的程度，分子質(zhì)量與消化產(chǎn)物的生物活性及消化吸收生物可利用度密切相關(guān)，3 種乳制品消化肽主要在500～1 000 Da之間，主要為小分子多肽，易于被胃腸道吸收。

2.1.3 3 種民族制品中源于酪蛋白和β-乳球蛋的消化肽

乳扇、乳餅和奶渣消化肽中源于酪蛋白和β-乳球蛋的肽段如表1所示。3 種乳制品消化肽中分別有58、52 條和43 條源于酪蛋白和β-乳球蛋。乳扇消化肽中源于β-酪蛋白的有18 條、αs1-酪蛋白16 條、αs2-酪蛋白11 條和β-乳球蛋白7 條；乳餅消化肽中源于β-酪蛋白的有20 條、αs1-酪蛋白7 條、αs2-酪蛋白11 條和β-乳球蛋白10 條；而奶渣消化肽中源于β-酪蛋白的有19 條、αs1-酪蛋白8 條、αs2-酪蛋白7 條、β-乳球蛋白6 條。3 種乳制品消化肽中來(lái)自于β-和α-酪蛋白的較多，原因是酪蛋白中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白含量較高，其靈活又開放的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它們很容易被酶解，此外胃蛋白酶和胰蛋白酶更傾向于酶解β-酪蛋白，特別是在具有208 ～209和209～210片段殘基的C末端部分以及具有殘基A的N末端部分特別容易被消化酶酶解，αs1-酪蛋白在包含殘基A1～R2的區(qū)域內(nèi)的N末端部分特別是39～40和40～41片段易被降解。在本次研究中源于κ-酪蛋白的蛋白肽在3 種乳制品含量較低，分別從乳扇、乳餅和奶渣的消化產(chǎn)物中鑒定到6、4 條和3 條源于κ-酪蛋白的蛋白肽，推斷是因?yàn)槿樯?、乳餅、奶渣成熟期短，?酪蛋白降解較少，此外和κ-酪蛋白對(duì)胃腸道消化酶的抵抗作用相關(guān)。乳餅和奶渣消化肽中源于αs1-酪蛋白的蛋白肽比乳扇中的少，推斷是差異物種之間的酪蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同或是不同的加工工藝所造成的。

2.2 乳扇、乳餅、奶渣蛋白肽的潛在生物活性

乳源蛋白在胃腸道消化中釋放產(chǎn)生的活性肽具有良好的吸收效果[19]，不僅能作為氨基酸的供體，而且也能作為生理調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用。本研究將乳扇、乳餅、奶渣消化肽中源于酪蛋白和β-乳球蛋的58、52 條和43 條通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，探索潛在的生物活性肽，結(jié)果如表2所示。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索注釋到乳扇潛在的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽5 條、免疫調(diào)節(jié)肽4 條、抗氧化肽3 條、抗血栓肽2 條以及抗菌肽1 條。其中源于αs1-酪蛋白f（001-024）的RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF[12]經(jīng)牛凝乳酶催化23～24片段肽鍵的水解釋放，并在伯南布哥州的傳統(tǒng)Coalho奶酪中發(fā)現(xiàn)，具有抗菌活性。源于αs1-酪蛋白f（001～036）的FVAPFPEVFGK由楊銘等[20]先后用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解酪蛋后分離得到，為ACE抑制肽；源于β-酪蛋白130～140片段和κ-酪蛋白106～116片段的LHLPLPL[21]和MAIPPKK[22]從發(fā)酵乳和GMP的胰蛋白酶水解物的胃腸道消化液中被鑒定，具有舒張動(dòng)脈的抗高血壓作用；源于β-酪蛋白98～105片段的VKEAMAPK[23]在干酪中被鑒定，為ACE抑制肽。源于αs1-酪蛋白80～90片段、αs2-酪蛋白150～188片段和β-酪蛋白170～176片段的KEDVPSER[24]、KTKLTEEEKNRL[25]和VLPVPQK[26]從干酪、GMP的胰蛋白酶水解物和水牛奶酪蛋白中鑒定出，均具有抗氧化活性。源于β-乳球蛋白70～77片段和αs2-酪蛋白174～181片段的KYPVEPF[27]和FALPQYLK[28]已從乳清奶酪和酪蛋白的胰酶水解物中被鑒定出，具有抗血栓活性。源于β-酪蛋白192～209片段的LYQEPVLGPVRGPFPI、LYQEPVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPI和QEPVLGPVRGPFPIIV[29]均具有免疫調(diào)節(jié)活性，主要由大量的肽酶，例如凝乳酶、組織蛋白酶和來(lái)自乳酸菌的能夠水解192～193片段肽鍵的酶酶解產(chǎn)生，因此該肽在不同的奶酪品種中被廣泛發(fā)現(xiàn)[30]。乳扇中鑒定到較多的生物活性肽，經(jīng)人體食用后能提供免疫調(diào)節(jié)、舒張血管、降低血壓等功效。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索注釋到乳餅、奶渣中潛在抗氧化肽2 條，和乳扇中的潛在抗氧化肽一致，為源于αs1-酪蛋白f（080～102）的KEDVPSER[24]和β-酪蛋白170～176片段的VLPVPQK[26]。此外，奶渣中還檢索注釋到免疫調(diào)節(jié)肽2 條和抗血栓肽1 條，源于β-酪蛋白192～209片段的LYQEPVLGPVRGPFPI和LYQEPVLGPVRGPFPIIV[29]具有免疫調(diào)節(jié)活性；源于κ-酪蛋白106～112片段具有潛在的抗血栓活性，能夠抑制ADP處理血小板的聚集和纖維蛋白原與ADP處理血小板的結(jié)合的MAIPPKK[22]。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到乳餅和奶渣中的潛在生物活性肽較少，原因是數(shù)據(jù)庫(kù)中的大多數(shù)生物活性肽都來(lái)自于牛乳蛋白，來(lái)自于羊乳蛋白的活性多肽較少，從而導(dǎo)致羊乳蛋白肽的很多活性肽都無(wú)法得到注釋。此外，牛和羊的蛋白質(zhì)存在差異，從而導(dǎo)致羊和牛蛋白質(zhì)之間缺乏匹配。

表1 乳扇、乳餅、奶渣消化產(chǎn)物蛋白肽氨基酸序列及分子質(zhì)量Table 1 Amino acid sequences and molecular masses of peptides from dairy fan, milk pastry and milk residue after simulated gastrointestinal digestion

肽組學(xué)分析顯示，酪蛋白中αs1-酪蛋白的1～36片段；β-酪蛋白的94～106、130～175和193～209片段以及κ-酪蛋白106～112片段的幾個(gè)區(qū)域?qū)ξ改c道消化特別敏感，β-酪蛋白因其結(jié)構(gòu)松散而更容易被消化酶酶解。3 種傳統(tǒng)乳制品消化肽中潛在的免疫調(diào)節(jié)肽和ACE抑制肽較多，對(duì)調(diào)節(jié)人體免疫和調(diào)整人體血壓方面具有一定的功效，夏鎮(zhèn)波[31]采用胃蛋白酶、胰蛋白酶分別水解酪蛋白，均可獲得ACE抑制肽，李素萍[32]研究表明乳源酪蛋白經(jīng)過(guò)胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解后可以生成免疫調(diào)節(jié)肽，與本研究結(jié)果一致。本研究未能檢索到3 種傳統(tǒng)乳制品中潛在的酪蛋白磷酸肽、阿片肽等生物活性多肽，但隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)成熟和應(yīng)用的深入，傳統(tǒng)乳制品中越來(lái)越多的生物活性肽將被發(fā)現(xiàn)。

表2 乳扇、乳餅、奶渣中的潛在生物活性肽Table 2 Potential biological activities of peptides from three ethnic dairy products

2.3 乳扇、乳餅、奶渣消化產(chǎn)物的游離氨基酸含量

氨基酸作為人體營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成物質(zhì)，也是食物經(jīng)消化后被攝入的主要成分，因此氨基酸均衡對(duì)機(jī)體健康起到至關(guān)重要的作用。由表3可知，乳扇、乳餅、奶渣經(jīng)模擬胃腸消化產(chǎn)物凍干粉中游離氨基酸豐富，除色氨酸外的其他所有氨基酸都被檢測(cè)到，3 種乳制品中乳餅消化產(chǎn)物的游離氨基酸含量最高為10.7 g/100 g，其次是乳扇（9.45 g/100 g）、奶渣（9.0 g/100 g）。乳扇消化產(chǎn)物中中性、堿性氨基酸和酸性氨基酸含量分別為5.664、4.767 g/100 g和0.275 g/100 g，乳餅消化產(chǎn)物中中性、堿性氨基酸和酸性氨基酸含量分別為5.084、4.053 g/100 g和0.31 g/100 g，奶渣消化產(chǎn)物中中性、堿性氨基酸和酸性氨基酸含量分別為4.937、3.793 g/100 g和0.271 g/100 g。3 種乳制品消化產(chǎn)物中中性氨基酸含量最高，其次依次是堿性氨基酸和酸性氨基酸。說(shuō)明3 種乳制品經(jīng)人體消化后的游離氨基酸豐富，利于人體的吸收，能提供豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表3 乳扇、乳餅、奶渣消化產(chǎn)物的游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of dairy fan, milk pastry and milk residue after simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

乳扇、乳餅和奶渣經(jīng)模擬消化后分別鑒定到221、225 條和220 條蛋白肽，主要源于β-和α-酪蛋白。乳扇肽分子質(zhì)量集中在500～750 Da，乳餅肽和奶渣肽分子質(zhì)量集中在750～1 000 Da。蛋白肽數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)乳扇中潛在的功能活性肽較豐富，包括ACE抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽、抗血栓以及抗菌肽。乳餅肽中檢索到的潛在生物活性肽較少，包括抗氧化肽2 條，原因可能是數(shù)據(jù)庫(kù)中的大多數(shù)生物活性肽與牛乳相對(duì)應(yīng)，對(duì)于羊乳產(chǎn)品中的多肽較少，很多肽段無(wú)法注釋到活性。奶渣潛在的功能活性肽為免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽和抗血栓肽。乳扇、乳餅和奶渣經(jīng)模擬消化液消化后的游離氨基酸含量分別為9.45、10.7 g/100 g和9 g/100 g，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。本研究可為云南民族特色乳制品進(jìn)一步開發(fā)提供參考依據(jù)。