外源酶對改善茶葉品質(zhì)作用的研究進展

薄佳慧，張楊玲，宮連瑾，杜哲儒，肖力爭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，茶學(xué)教育部重點實驗室，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

酶工程技術(shù)與茶葉生產(chǎn)相結(jié)合最早可追溯到上世紀(jì)70年代[1]，現(xiàn)階段，該技術(shù)已經(jīng)成為茶葉加工領(lǐng)域提高茶葉品質(zhì)的主要外援技術(shù)之一。有研究人員將茶葉加工中采用的外源酶定義為在茶葉生產(chǎn)過程中，通過人為施加的多種來源酶類，包括從茶鮮葉、茶幼果、其它植物或其愈傷組織以及微生物培養(yǎng)基中提取獲得的酶[2-4]，但茶鮮葉、茶幼果中提取的生物酶是否屬于茶葉加工中的外源酶還有待進一步探討。如今，隨著生物技術(shù)應(yīng)用的飛速發(fā)展，酶技術(shù)有了革命性的變化，利用酶促反應(yīng)原理將外源酶與茶葉生產(chǎn)相結(jié)合對提高各類茶葉的品質(zhì)均有重要作用。生產(chǎn)加工是繼鮮葉采摘后決定茶葉品質(zhì)的第一步，在茶葉加工過程中外源酶的應(yīng)用主要表現(xiàn)為利用酶高效的生物催化能力，促進茶葉中不利、低效或無效成分的有利轉(zhuǎn)化，改善成品茶的色、香、味等風(fēng)味特征及營養(yǎng)價值。通過綜述外源酶技術(shù)在茶葉初加工中的研究及其應(yīng)用，為茶葉加工中的酶法應(yīng)用提供一定的理論借鑒，進一步促進茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，滿足消費者對茶產(chǎn)品日益豐富的消費需求。

1 應(yīng)用于茶葉加工中的外源酶

在茶葉加工中應(yīng)用較多的外源酶類主要包括外源單寧酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，這些外源酶可促進茶葉細(xì)胞壁的溶解，同時被破壞的細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)會進一步發(fā)生酶促和氧化反應(yīng)，在一定程度上提高或降低影響茶葉品質(zhì)的某些成分含量。

1.1 主要外源酶及其作用機理

單寧酶，屬水解酶，外源單寧酶主要來自于曲霉，且制備技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟[5-6]。從植物材料中釋放的外源水解酶具有裂解作用，能夠有效裂解植物中化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞纖維素骨架之間的化學(xué)鍵[7]，專一性斷裂茶葉內(nèi)沒食子單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵。外源單寧酶可有效促進沉淀的復(fù)溶和回收利用，進而提高茶湯的澄清度、透明度和色澤[8-10]。單寧酶是茶葉加工中運用最多的外源酶類，被廣泛應(yīng)用于綠茶、紅茶、烏龍茶、黑茶等茶類中。

纖維素酶是能將纖維素降解為葡萄糖的復(fù)合酶系，亦屬水解酶，其來源主要為微生物真菌和曲霉，同時利用茶渣也可以產(chǎn)生纖維素酶[11]。應(yīng)用于茶葉生產(chǎn)中能夠提高可溶性糖和水浸出物的含量及芳香性物質(zhì)的釋放[12-13]。

果膠酶主要作用于在制茶葉細(xì)胞壁中的果膠類物質(zhì)，促使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞與解離，同時，果膠酶對茶湯澄清度的改善有顯著作用，果膠酶與纖維素酶組成復(fù)合酶應(yīng)用于茶葉生產(chǎn)實際中效果更佳。

蛋白酶是能水解蛋白質(zhì)肽鍵的專一酶類，微生物、細(xì)菌、真菌是蛋白酶的主要來源[14]。蛋白酶可提高茶葉中氨基酸含量，有助于滋味物質(zhì)和香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，并能顯著提高茶湯透光率，使茶湯更澄澈[15]。其中，堿性蛋白酶對茶葉籽和茶渣所含蛋白的酶解作用較強，且酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力較好[16-17]。

多酚氧化酶是一類含銅質(zhì)體的氧化還原酶，能催化多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)[18]，廣義上的多酚氧化酶包括酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。多酚氧化酶能夠催化兒茶素氧化形成茶黃素和茶褐素，漆酶可以通過與聚合物的自偶聯(lián)或交叉偶聯(lián)來轉(zhuǎn)化酚類物質(zhì)，從而改善茶葉品質(zhì)。

1.2 其它外源酶

以上5種外源酶均能對茶湯的澄清度、香氣以及內(nèi)含物質(zhì)產(chǎn)生重要影響，除上述5種應(yīng)用較為廣泛的外源酶類，淀粉酶在茶葉加工中的應(yīng)用亦較多。淀粉酶具有良好的活性、底物特異性、熱穩(wěn)定性、較寬的pH值等特性，且對變性劑和重金屬有良好的抗性[19]。除此之外，利用α-淀粉酶的活性抑制率，優(yōu)化茉莉花茶的拼配工藝，可制得具備降血糖功效顯著且感官品質(zhì)優(yōu)異的茉莉花茶拼配茶[20]。通過在黑毛茶渥堆過程中添加淀粉酶研究發(fā)現(xiàn)，茶湯中茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖和水浸出物的含量均明顯增加[21]。此外，木瓜蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、α-半乳糖苷酶以及其它植物酶等外源酶類可以單獨或組成復(fù)合酶，不同程度地應(yīng)用在各類茶葉加工過程中[22-24]。

2 外源酶在提升茶葉品質(zhì)中的應(yīng)用

茶葉品質(zhì)的形成與人工所創(chuàng)造的外部條件有一定關(guān)系，如利用或控制外源酶，使茶葉發(fā)生一系列理化變化從而加速或更穩(wěn)定地形成某類茶特有品質(zhì)[25]。目前，外源酶技術(shù)主要集中于提高夏秋茶風(fēng)味品質(zhì)及茶資源高效利用率兩個方面。由于夏秋茶中茶多酚、咖啡堿含量所占比例較高，游離氨基酸含量較低，因此所制成品茶苦澀味重[26]，致使大部分茶區(qū)對夏秋茶利用程度偏低。采用添加外源酶制劑的方法，選擇合適的酶類運用于茶葉加工中可以有效降低茶多酚、兒茶素等具有苦澀味的成分，提高可溶性糖、茶氨酸、非沒食子酸等非苦澀味成分，改善茶葉口感和接受度。

2.1 外源酶于綠茶加工中的應(yīng)用

綠茶富含兒茶素等多酚類成分，具有豐富的藥理活性，抗菌作用顯著[27]。由于秋茶兒茶素含量較高且茶葉中含有沒食子兒茶素（gallocatechin，GC），由秋季茶鮮葉加工而成的綠茶比由春葉加工而成的綠茶更苦、更澀。綠茶加工中外源酶的應(yīng)用常見于揉捻階段，在秋季綠茶揉捻階段加入500 U/g單寧酶（單寧酶提前溶于100 mL 5℃的水），可將GC水解為非沒食子兒茶素和沒食子酸（galllic acid，GA），隨著外源單寧酶用量的增加，綠茶浸出物的苦味和澀味強度降低，而甜味和接受度整體提高，明顯改善了秋季綠茶產(chǎn)品的口感[28-29]；于夏季綠茶揉捻工序中添加外源單寧酶，同樣可使夏茶的苦澀味降低，鮮醇度增高,木瓜蛋白酶和纖維素酶則能明顯提高茶湯中氨基酸與可溶性糖的含量,并與添加的外源酶濃度呈顯著正相關(guān)[30-31]。

2.2 外源酶于白茶加工中的應(yīng)用

有研究報道，影響白茶茶湯浸提液中茶多酚浸出量的順序依次為浸提溫度、時間、酶添加量[32]。以夏季福鼎大毫茶為原料，在萎凋葉失重率達到30%時噴灑液葉比（外源酶液與在加工茶葉的質(zhì)量比）為1∶10的1.0%果膠酶對白茶品質(zhì)的提升效果顯著，此外纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶3種外源酶處理均能顯著提高茶湯中的水浸出物、可溶性糖、氨基酸含量，大幅改善茶湯品質(zhì)，與未添加外源酶的白茶差異達到顯著或極顯著差異[33]。張艷梅等[23]在采用紫鵑品種制作白茶的萎凋過程中，利用外源脂肪酶并融合輕微包揉和輕微發(fā)酵的新工藝，發(fā)現(xiàn)該紫鵑白茶在香氣、滋味等各方面都優(yōu)于對照組，茶氨酸、茶多酚、可溶性糖和花青素含量明顯提升。

2.3 外源酶于黃茶加工中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在黃茶殺青或揉捻工序中添加來自茶鮮葉中獲取的粗酶液（內(nèi)含茶多酚、兒茶素、游離氨基酸、可溶性糖），“酶促黃變”效果明顯，顯著降低了黃茶內(nèi)茶多酚含量和葉綠素含量，提高了可溶性糖、茶黃素和茶紅素含量，在保留傳統(tǒng)黃茶品質(zhì)特征的基礎(chǔ)上，進一步改善了黃茶的總體品質(zhì)，但此粗酶液要保證現(xiàn)制現(xiàn)用，充分保證酶活力[34]。

2.4 外源酶于青茶加工中的應(yīng)用

夏季烏龍茶可溶性糖含量較少，茶多酚和咖啡堿含量較高，苦澀味明顯，香氣較差，在提高產(chǎn)量的前提下改善夏茶整體品質(zhì)尤為重要。有研究在10 kg安溪鐵觀音夏茶干燥過程中，噴灑220 mL濃度為0.075 g/L的漆酶和0.2 g/L的α-半乳糖苷酶水溶液，充分干燥后茶葉中兒茶素和總多酚含量分別降低了11.9%和13.3%，可溶性糖和水浸出物含量分別提高了19.4%和6.6%，揮發(fā)性成分顯著增加，成茶的滋味和香氣明顯改善[24]；在揉捻階段加入外源β-葡萄糖苷酶能促使烏龍茶芳樟醇及其氧化物和相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的大量釋放，提高烏龍茶干茶香氣和滋味[35]；搖青后使用β-葡萄糖苷酶和漆酶處理能顯著提高鐵觀音香氣成分含量，在初烘前添加漆酶和α-半乳糖苷酶能改善夏茶的香氣和滋味品質(zhì)，二者復(fù)合使用時，制得的夏茶品質(zhì)類似早秋茶[36]。

鐵觀音品質(zhì)的不穩(wěn)定性是導(dǎo)致其近幾年市場占有率大幅縮小的原因之一，利用固態(tài)發(fā)酵獲得的單寧酶對劣質(zhì)鐵觀音進行二次加工，可催化水解表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC），并能提高水解產(chǎn)物的抗氧化活性與耐低溫儲藏性[37]。黑曲霉發(fā)酵可以產(chǎn)生多種胞外蛋白酶組分,是常用的食品酶制劑生產(chǎn)菌株。李紅[38]利用察氏、果膠、柚皮、麥麩以及茶葉梗等培養(yǎng)基所得黑曲霉酶液制備胞外酶，用該胞外酶處理后的烏龍茶茶湯香氣物質(zhì)含量明顯提高，其中茶梗培養(yǎng)基所得酶液可使茶湯苦澀味明顯降低，但酸味明顯?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論，外源酶可運用于烏龍茶加工的多個階段，其中以漆酶與半乳糖苷酶的酶學(xué)特性較為一致，相互影響小，適合作為復(fù)合酶使用且效果較為突出，但過量的漆酶會使得茶湯滋味平淡，過高濃度的半乳糖苷酶會導(dǎo)致香氣不持久等問題。

2.5 外源酶于紅茶加工中的應(yīng)用

紅茶以紅濃明亮的茶湯、甜香和甜醇的滋味為品質(zhì)特征，發(fā)酵是紅茶加工的關(guān)鍵工藝，以促進多酚氧化酶的充分氧化為目的。在紅茶發(fā)酵過程中添加來自茶葉真菌制備純化后的纖維素酶、漆酶、果膠酶和木聚糖酶，纖維素酶和漆酶的體積比為3∶2時紅茶品質(zhì)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝紅茶[39]。茉莉酸甲酯被廣泛應(yīng)用于提高食品質(zhì)量，用外源茉莉酸甲酯噴灑龍井43號茶樹上的鮮葉，后采摘制成紅茶，紅茶內(nèi)的多酚氧化酶和β-原氧化酶的基因表達水平分別上調(diào)了2倍和3倍，萜烯醇和己烯酯的含量顯著增加，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生了諸如胡椒烯、山蒼子醇和吲哚等新的揮發(fā)性成分，香氣質(zhì)量明顯高于未處理的紅茶[40]。利用纖維素酶和木瓜蛋白酶組成復(fù)合酶處理萎凋階段的英紅九號，能極大提高英紅九號可溶性糖的含量和茶多酚的含量[41]。研究發(fā)現(xiàn)，砂梨多酚氧化酶、外源纖維素酶、木聚糖酶及木瓜蛋白酶處理均可提高紅茶茶湯可溶性糖含量，促進紅茶發(fā)酵和茶紅素、茶黃素的生成，從而改善茶湯的色澤和香氣[42-43]。外源酶的應(yīng)用可充分提高茶湯的甜度和香氣的持久度，對紅茶品質(zhì)的提升具有極其顯著的積極作用。

2.6 外源酶于黑茶加工中的應(yīng)用

黑茶屬于后發(fā)酵茶，在其渥堆發(fā)酵過程中，真菌對初制黑茶性狀的形成有很大的貢獻，真菌外源酶在黑茶初制過程中也可起到重要作用，在渥堆期間黑毛茶中的微生物群落除了不能產(chǎn)生過氧化物酶活性外，多酚氧化酶、纖維素酶和果膠酶的活性均有不同程度增加[44]。外源酶技術(shù)在黑茶加工中的應(yīng)用研究頗豐，針對云南普洱茶、廣西六堡茶、四川磚茶等的各階段工藝均有研究。

酶活性與普洱茶生產(chǎn)過程中的成分變化與其質(zhì)量密切相關(guān)，聯(lián)合利用纖維素酶、果膠酶、多酚氧化酶、多糖水解酶類、單寧酶、蛋白酶等制成復(fù)合酶制劑對云南大葉種曬青毛茶進行液態(tài)發(fā)酵，可顯著縮短發(fā)酵周期，促進發(fā)酵葉營養(yǎng)物質(zhì)的形成，大幅度降低多酚含量，提高茶黃素、總碳水化合物、多糖、氨基酸和蛋白質(zhì)含量，促進內(nèi)含物質(zhì)氧化[45-46]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)添加不同濃度外源酶均可顯著調(diào)節(jié)普洱生茶浸提液內(nèi)含成分的比例，當(dāng)漆酶與蛋白酶、單寧酶3種酶以一定比例對該浸提液進行處理時，可溶性糖、氨基酸及茶褐素含量分別是未處理前的3.49倍、1.10倍、4.32倍，其中，漆酶對茶褐素氧化貢獻最大，該研究為實現(xiàn)普洱茶走向酶法快速提高茶品質(zhì)的液態(tài)化產(chǎn)業(yè)道路奠定了一定基礎(chǔ)[47-48]。在六堡茶渥堆過程中添加外源纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及過氧化物酶可以明顯提高其水浸出率，且有利于色素轉(zhuǎn)化，縮短渥堆的時間從而改善茶葉的品質(zhì)[49-50]。另外，有研究通過向四川黑毛茶加入土豆外源酶，并結(jié)合濕熱處理，發(fā)現(xiàn)顯著增加了β-芳樟醇、α-雪松醇等花果香型物質(zhì)，明顯降低了陳味和霉味，改善了四川黑毛茶的總體品質(zhì)[51]。

3 結(jié)論和展望

外源酶制劑在茶葉初加工中的應(yīng)用主要集中在提高茶葉風(fēng)味、改善口感、促進結(jié)構(gòu)衍生以增加或減少某些內(nèi)含成分等方面。目前，我國各大茶產(chǎn)區(qū)普遍存在夏秋茶及中低檔茶資源利用率偏低的問題，基于六大茶類的品質(zhì)特征、制作工藝及品質(zhì)提升的重要性，研究人員將六大茶類加工工藝與外源酶技術(shù)相結(jié)合，成功實現(xiàn)了快速、高效生產(chǎn)風(fēng)味俱佳的茶葉。同時從粗老葉、茶梗等茶廢棄物中可提取一定的酶繼續(xù)作用于茶葉加工過程，既環(huán)保節(jié)約又有效提高茶資源利用率。

然而，酶技術(shù)的推廣應(yīng)用將是對傳統(tǒng)制茶工藝的一種挑戰(zhàn)，當(dāng)前外源酶作用于茶葉所發(fā)生的系列反應(yīng)機理還尚不清晰，這也是引起人們對外源酶與茶葉生產(chǎn)相結(jié)合是否安全的顧慮源頭。當(dāng)前有關(guān)改進茶葉品質(zhì)的外源酶種類方面的研究依舊不足，如何根據(jù)不同條件選擇適合的酶來源、種類和配比是今后外源酶應(yīng)用在各大茶類加工中需要解決的主要問題之一，同時酶的保存期限、穩(wěn)定性、封裝材料以及不同茶類添加外源酶的最佳工藝參數(shù)的探索仍有待進一步探索。因此，未來可結(jié)合蛋白組學(xué)分析多酶組學(xué)活性，為實現(xiàn)外源酶技術(shù)在茶葉生產(chǎn)加工中發(fā)揮安全穩(wěn)定高效的作用。