分子標(biāo)記輔助選育聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性基因（L4）及馬鈴薯Y病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

我國(guó)是世界上辣椒栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國(guó)家（http：//www.FAO.org）。辣椒已成為我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)（王立浩 等，2019）。長(zhǎng)期以來(lái)，病毒病一直是制約辣（甜）椒生產(chǎn)的主要因素之一。據(jù)報(bào)道，至少有20 余種主要的病毒可侵染辣椒和甜椒（Moury & Verdin，2012），其中煙草花葉病毒屬病毒（Tobamovirus）和馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）是侵染辣椒最為普遍的病害，在我國(guó)多地辣椒產(chǎn)區(qū)均有檢出（郭思瑤 等，2015；劉勇 等，2019），嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)。

辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）是煙草花葉病毒屬的典型成員，煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）也是該病毒屬病毒，在辣椒生產(chǎn)上發(fā)生十分普遍（王亞南，2008；秦蕾和梁燕，2016）。根據(jù)煙草花葉病毒屬病毒和其抗性基因L的致病關(guān)系，可將其分為5 種致病型：P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)于1994 年首次在新疆產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)（向本春等，1994），之后在多地均有檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（黃粵 等，2005；李興紅 等，2005；夏惠娟 等，2006；Wang et al.，2006），檢出比例較高。劉勇等（2019）于2013—2017 年對(duì)我國(guó)31 個(gè)省（市、自治區(qū)）開(kāi)展辣椒主要病毒病發(fā)生情況調(diào)查，結(jié)果表明PMMoV檢出比例僅次于TMV 和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）。PMMoV 通過(guò)帶毒種子、感病植株和感病土壤均可傳播，病毒在干燥的植物病殘?bào)w上可存活25 a，防治極為困難?？共∮N是防治該病毒病最有效方式之一。L系列等位基因（L1、L2、L3、L4）是煙草花葉病毒屬的主要抗性基因（Boukema，1980，1982；Genda et al.，2007；Tomita et al.，2011），已在辣椒抗煙草花葉病毒屬病毒育種上得到廣泛應(yīng)用。L4基因最早在辣椒種C.chacoense資源PI 260429 中被鑒定發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)煵莼ㄈ~病毒屬病毒（TMV、ToMV、PMMoV）具有廣泛抗性，除P1，2，3，4致病型外，對(duì)其余4種致病型均具有抗性（Genda et al.，2007）。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者先后開(kāi)發(fā)或轉(zhuǎn)化獲得與L4基因連鎖的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各類(lèi)型標(biāo)記（Matsunaga et al.，2003；Kim et al.，2008；Yang et al.，2009，2012）。L基因特異分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)可以快速篩選鑒定含有L基因的抗性資源，提高抗病基因轉(zhuǎn)育的效率。

馬鈴薯Y 病毒屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），寄主廣泛，可侵染馬鈴薯、煙草、番茄和辣椒等茄科作物，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生。主要依靠蚜蟲(chóng)（以綠色桃蚜為主）以非持久方式進(jìn)行傳播（Green & Kim，1991；李寧 等，2018）。目前在辣椒上已鑒定出多個(gè)PVY 的抗性基因（Cook，1960；Dogimont et al.，1996；Caranta et al.，1999），其中Pvr4基因?yàn)轱@性，來(lái)源于辣椒材料CM334（Criollo de Morelos-334’，Dogimont et al.，1996），該材料對(duì)PVY 的所有3 個(gè)小種PVY（0）、PVY（1）、PVY（1，2）和PepMoV 均表現(xiàn)為抗病，還未有該基因抗性被克服的報(bào)道。目前已開(kāi)發(fā)和報(bào)道了與PVY 抗性基因Pvr4連鎖的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各 類(lèi) 型 標(biāo) 記（Caranta et al.，1999；Arnedoandrés et al.，2002；Devran et al.，2015），可應(yīng)用于辣椒抗病材料輔助選擇和抗病基因轉(zhuǎn)育中。

本試驗(yàn)以創(chuàng)制聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性基因（L4）和馬鈴薯Y 病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系為主要目標(biāo)，利用引進(jìn)的抗源材料，采用常規(guī)回交轉(zhuǎn)育、分子標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）結(jié)合田間抗病性鑒定的方法，將抗性基因Pvr4和L4轉(zhuǎn)育聚合到甜椒優(yōu)異自交系83-163 中，為今后多抗辣（甜）椒品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜椒83-163 為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組選育的大果型甜椒自交系，果實(shí)方燈籠形（縱徑8.2 cm，橫徑7.1 cm），綜合性狀優(yōu)良，早熟性好，中抗疫病和CMV，配合力強(qiáng)，是中椒系列品種的親本之一，但其對(duì)PMMoV 和PVY 表現(xiàn)高感（圖1）。CM334（引種號(hào)200380）和200375（引種號(hào)200375）均是本課題組2003 年從法國(guó)引進(jìn)的種質(zhì)資源，CM334 果實(shí)短錐形（縱徑6.3 cm，橫徑2.5 cm），植株分枝性強(qiáng)，莖部絨毛明顯，田間病毒病抗性好，人工接種PVY 致病型PVY（1，2）后，有過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)，PVY 抗性表現(xiàn)高抗，含有Pvr4抗性位點(diǎn)。200375（C.annuumL.）為一年生辣椒，L4抗性位點(diǎn)來(lái)自C.chacoense（PI 260429），為轉(zhuǎn)育后經(jīng)過(guò)高代分離的純合材料，果實(shí)方燈籠形（縱徑7.1 cm，橫徑6.5 cm），人工接種鑒定PMMoV（P1，2，3）抗性表現(xiàn)高抗。

1.2 馬鈴薯Y 病毒和辣椒輕斑駁病毒人工接種鑒定

PVY 和PMMoV 人工接種鑒定在法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院Benoit Moury 博士實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，PVY 和PMMoV 接種鑒定方法分別參考Caranta 和Palloix（1996）及Kim 等（2008）的方法。PVY 鑒定株系為PVYson41（P1，2），PMMoV 鑒定株系為PMMoV（P1，2，3），每個(gè)材料接種30 株，接種15～20 d 后進(jìn)行調(diào)查。

1.3 選育過(guò)程

自2005 年，分別以材料CM334（抗PVY，含Pvr4基因）和200375（抗PMMoV，含L4基因）為抗源，以甜椒自交系83-163（中抗疫病和CMV）為回交親本，進(jìn)行兩兩雜交。PVY 抗性鑒定利用Pvr4特異CAPS 標(biāo)記（Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999）對(duì)回交后代分別進(jìn)行單株選擇；PMMoV 抗性鑒定利用人工接種的過(guò)敏性反應(yīng)進(jìn)行單株選擇，對(duì)回交后代的園藝性狀進(jìn)行調(diào)查，保留園藝性狀近于回交親本83-163 的多個(gè)BC4抗病單株。然后將含有L4位點(diǎn)（83-163L4）和Pvr4位點(diǎn)（83-163Pvr4）BC4材料進(jìn)行雜交，自交2 代，輔助分子標(biāo)記選擇（L4-SCAR，Kim et al.，2008；Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999），獲得聚合L4和Pvr4位點(diǎn)的多個(gè)BC4F2單株（PT83-163BC4F2）。對(duì)每單株后代自交留種，利用標(biāo)記篩選，最終確定抗性位點(diǎn)Pvr4和L4均純合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），自交2 代后獲得PT83-163BC4F4后代，對(duì)其進(jìn)行性狀觀察和人工接種抗病性鑒定，詳細(xì)轉(zhuǎn)育過(guò)程如圖2所示。

1.4 DNA 提取及分子標(biāo)記輔助選擇

植物基因組DNA 提取采用改良CTAB 方法（Saghai-Maroof et al.，1984）。利用L4基因特異標(biāo)記L4-SCAR 對(duì)后代進(jìn)行篩選，PCR 反應(yīng)體系參考Kim 等（2008）的方法，擴(kuò)增后PCR 產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為140 V，30 min。利用Pvr4基因特異標(biāo)記Pvr4-CAPS 對(duì)后代Pvr4陽(yáng)性株進(jìn)行篩選，PCR 反應(yīng)體系參考Caranta 等（1999）的方法，擴(kuò)增后PCR 產(chǎn)物利用AlwNⅠ酶切過(guò)夜后，利用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)（抗病，444 bp；感病，458 bp），恒壓160 V，2.5～3.0 h，快速銀染法染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期人工接種鑒定200375 與83-163 后代的PMMoV 抗性

利用人工接種鑒定的方法篩選200375×83-163 后代中PMMoV 抗病單株（圖3），接種后2 周內(nèi)觀察植株是否有過(guò)敏性反應(yīng)出現(xiàn)。出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)，表現(xiàn)抗病的單株保留，并繼續(xù)回交。最終獲得抗病單株BC4（83-163L4）。

2.2 分子標(biāo)記輔助轉(zhuǎn)育Pvr4 抗性基因

利用Pvr4特異分子標(biāo)記Pvr4-CAPS 分別對(duì)83-163×CM334 的雜交及回交后代進(jìn)行篩選，保留陽(yáng)性單株并進(jìn)行回交。圖4 為BC4（83-163 ×CM334）群體部分單株篩選結(jié)果，63 株BC4后代中，26 株經(jīng)AlwNⅠ酶切后獲得了抗病特異條帶（444 bp，單株泳道1、5、9、10、11、13、14、15、16、17、24、26、32、34、35、40、42、43、45、50、51、57、58、60、61、62），且?guī)途鶠殡s合，陽(yáng)性單株比例接近1∶1。

2.3 分子標(biāo)記輔助選育聚合抗病基因L4 和Pvr4甜椒自交系PT83-163

利用抗病基因L4連鎖標(biāo)記L4-SCAR 和Pvr4連鎖標(biāo)記Pvr4-CAPS 篩選83-163Pvr4×83-163L4的雜 交BC4F1和BC4F2群體，保留L4和Pvr4基 因檢測(cè)均為陽(yáng)性的單株并進(jìn)行自交。圖5 為PT83-163BC4F1部分單株L4-SCAR 標(biāo)記篩選結(jié)果，含有L4基因的單株可擴(kuò)增出抗病特異條帶（340 bp）。結(jié)果顯示，46 株單株中，25 株經(jīng)檢測(cè)含有L4基因，抗性分離比例接近1∶1。

獲得PT83-163BC4F2群體中聚合L4和Pvr4位點(diǎn)的多個(gè)陽(yáng)性單株后，對(duì)每個(gè)單株分別自交留種。每個(gè)單株挑取30 株自交后代，利用標(biāo)記L4-SCAR 和Pvr4-CAPS 進(jìn)行篩選，保留后代中2 個(gè)抗性位點(diǎn)Pvr4和L4均純合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），對(duì)該株系自交2 代，最終獲得PT83-163BC4F4（Pvr4Pvr4&L4L4）后代。

2.4 甜椒自交系PT83-163 的PMMoV 和PVY 抗性人工接種鑒定

2013 年委托法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)含有L4和Pvr4抗性位點(diǎn)的PT83-163BC4F4株系的后代進(jìn)行PMMoV 和PVY 的人工接種抗病性鑒定。結(jié)果表明（表1），PT83-163BC4F4的后代對(duì)PVY（P1，2）和PMMoV（P1，2，3）均表現(xiàn)為抗病，83-163 和感病對(duì)照Yolo wonder 均表現(xiàn)感病。

表1 PT83-163BC4F5 人工接種抗病性鑒定結(jié)果

2.5 PT83-163 園藝性狀表現(xiàn)

田間農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，聚合L4和Pvr4位點(diǎn)的PT83-163BC4F4株系與原輪回親本甜椒自交系83-163 的植株、葉、花、果等農(nóng)藝性狀均接近（圖6），果實(shí)方燈籠形，4 心室，早熟，定植后25 d 商品成熟，果肉薄，青熟果綠色，老熟果紅色，果面微皺，單果質(zhì)量150 g。

3 結(jié)論與討論

隨著越來(lái)越多的基因被定位和克隆，分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)的完善和標(biāo)記類(lèi)型的增多，分子標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）在育種中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，特別是對(duì)于一些不能直接通過(guò)表型觀察和田間鑒定的性狀如產(chǎn)量、抗病性、抗逆性，以及多個(gè)性狀的聚合，MAS 優(yōu)勢(shì)明顯。如傳統(tǒng)抗病育種很難實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗性基因的聚合，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且存在鑒定結(jié)果重復(fù)性差、周期長(zhǎng)等問(wèn)題，MAS的應(yīng)用可以大大提高育種效率，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前在辣椒上已獲得了大量與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記（Tai et al.，1999；Sugita et al.，2004；Kim et al.，2008；Kang et al.，2010；王立浩 等，2012；Liu et al.，2014；Sun et al.，2015），本試驗(yàn)利用L4位點(diǎn)連鎖標(biāo)記L4-SCAR 和Pvr4位點(diǎn)連鎖標(biāo)記Pvr4-CAPS 對(duì)后代進(jìn)行選擇，擴(kuò)增條帶穩(wěn)定，分子標(biāo)記選擇結(jié)果與田間人工接種鑒定結(jié)果一致，結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了育種的效率和準(zhǔn)確性。因此，在今后工作中應(yīng)更加注重分子標(biāo)記與育種的結(jié)合。

病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要病害，常導(dǎo)致辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對(duì)辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失（秦蕾 等，2017；于海龍 等，2019）。其中煙草花葉病毒屬病毒（Tobamovirus）一直是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病毒，據(jù)報(bào)道該屬中有13 種病毒能夠侵染茄科作物并引起嚴(yán)重危害（Li et al.，2018）。PMMoV 近些年在我國(guó)多地辣椒產(chǎn)區(qū)被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，主要分為P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4等3 種致病型（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。目 前我國(guó)辣椒生產(chǎn)上PMMoV 致病型多以P1，2株系為主（張強(qiáng) 等，2014；李廷芳，2016），L3基因?qū)煵莼ㄈ~病毒屬病毒PMMoV（P1，2），P0（ToMV）和P1（paprika mild mottle virus，PaMMV）株系類(lèi)型均具有抗性。本課題組在前期研究中已育成多個(gè)含有L3基因辣（甜）椒品種，在生產(chǎn)中的PMMoV抗性表現(xiàn)良好。L4基因?qū)Τ齈1，2，3，4致病型外的其余4 種致病型均具有廣泛抗性，轉(zhuǎn)育L4基因?qū)τ趪?guó)內(nèi)辣椒抗病育種具有重要的前瞻意義。本試驗(yàn)利用分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合回交育種，實(shí)現(xiàn)了聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性位點(diǎn)L4和PVY 抗性位點(diǎn)Pvr4的骨干自交系83-163 的種質(zhì)創(chuàng)新，經(jīng)人工接種鑒定PT83-163 對(duì)PMMoV 和PVY 均表現(xiàn)抗病，可用于下一步雜交組合的配制，為實(shí)現(xiàn)辣椒品種多個(gè)抗性基因的聚合提供了借鑒思路。