血清lncRNA NEAT1和外周血T細(xì)胞亞群水平對宮頸癌組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值

翁艷潔 熊敏 葉雙梅 郝星 任武 白劍

近年來，我國宮頸癌患者逐年遞增，呈年輕化趨勢，給醫(yī)療和個(gè)體帶來了極大的負(fù)擔(dān)[1]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因[2]。HPV感染導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視清除障礙，即機(jī)體對同一種類型的高危HPV清除失敗并長期持續(xù)感染會導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量在相當(dāng)大程度上決定體內(nèi)細(xì)胞免疫功能水平，臨床上可以檢測T細(xì)胞亞群的比例來反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類參與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號過程的RNA分子，其在人血清中豐富且穩(wěn)定[4]，核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)是lncRNA的一種。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5]，有可能成為某些惡性腫瘤的特異性生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。目前宮頸癌綜合治療后主要靠影像學(xué)評估預(yù)后情況，尚無明確的血清學(xué)檢測手段來預(yù)測預(yù)后。組織分化程度和是否有淋巴轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌術(shù)后化療及預(yù)后的重要因素，lncRNA NEAT1在宮頸癌患者體內(nèi)表達(dá)水平與組織分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍不清楚。因此，探討宮頸癌患者體內(nèi)lncRNA NEAT1表達(dá)水平及T細(xì)胞的數(shù)量及亞群比例，有助于為宮頸癌的早期診斷及評估預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

對象與方法

一、一般資料

選取2017年1月至2019年10月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的172例宮頸癌患者為研究對象，所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診，符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期Ⅰ～Ⅲ期[7]；③既往未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整；⑤手術(shù)治療6個(gè)月后確定無腫瘤復(fù)發(fā)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神異?；虿荒芘浜媳狙芯康幕颊?；②患者因患宮頸癌及相關(guān)疾病已進(jìn)行手術(shù)的患者；③基礎(chǔ)疾病病情嚴(yán)重，無法承受手術(shù)的患者；④患有其他生殖道疾病的患者。172例患者年齡28～64歲，平均(47.25±7.01)歲；身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)18～26 kg/m2，平均(22.36±3.41)kg/m2；腫瘤直徑：<4 cm 115例，≥4 cm 57例；FIGO分期：Ⅰ期82例，Ⅱ期65例，Ⅲ期25例；肌層浸潤深度：淺肌層75例，深肌層97例；病理類型：鱗癌90例，腺癌82例。本研究經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

二、研究方法

所有患者術(shù)前均抽取晨起空腹靜脈血，進(jìn)行以下檢測：①取外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸二鉀抗凝后使用 FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特，中國)檢測外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)比例。②取靜脈血10 ml，離心后分離上層血清并儲存于-20 ℃待用。血清鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen， SCCA)采用I2000全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑(貝克曼庫爾特，中國)進(jìn)行檢測；血清糖類抗原(carbohydrate antigen, CA)125采用E170型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(上海羅氏制藥有限公司，中國)進(jìn)行檢測。③血清lncRNA NEAT1表達(dá)檢測：采用Stratagene MX300P系統(tǒng)(安捷倫科技公司，美國)熒光定量PCR檢測血清lncRNA NEAT1的表達(dá)水平。以RNA提取試劑盒提取樣本血清總RNA，紫外分光光度法鑒定各樣本提取的RNA純度和完整性。按TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。lncRNA NEAT1上游引物：5′-GUCUGUGUGGAAGGAGGAATT-3′、下游引 物： 5′-UUCCUCCUUCCACACAGACTT-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物： 5′-GGGAGCCAAAAGGGTCHH-AT-3′、下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μl：cDNA樣本1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR Green Premix 8 μl，不含RNase去離子水10 μl。選擇定量PCR反應(yīng)程序，共40個(gè)PCR循環(huán)，定量PCR擴(kuò)增條件:42 ℃，30 min；94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；60 ℃，80 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

三、數(shù)據(jù)采集與分組

參照《NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南(2018版)》[8]對患者進(jìn)行治療，采用標(biāo)準(zhǔn)的宮頸癌分期手術(shù)：ⅠA1期行筋膜外子宮切除術(shù)；ⅠA2期行改良廣泛性子宮全切及盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)；Ⅰ B1期至Ⅱ A期行廣泛子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)切除及腹主動脈旁淋巴取樣；ⅡB期至Ⅲ期選擇盆腔外照射+陰道近距離放療+含鉑同期化療±主動脈旁淋巴結(jié)放療。在患者術(shù)后第一次入院化療時(shí)采集臨床病理特征的相關(guān)數(shù)據(jù)，如病理類型、組織分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。根據(jù)宮頸癌組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，將所有患者分為以下4組：A組(高中分化無淋巴轉(zhuǎn)移組，43例)，B組(高中分化有淋巴轉(zhuǎn)移組，43例)，C組(低分化無淋巴轉(zhuǎn)移組，43例)，D組(低分化有淋巴轉(zhuǎn)移組，43例)[9-10]。4組患者基本情況構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組患者基本情況

四、觀察指標(biāo)

比較4組研究對象外周血中CD3+、CD4+、CD8+、Treg細(xì)胞數(shù)量和血清中l(wèi)ncRNA NEAT1、SCCA、CA125的表達(dá)水平以及血清lncRNA NEAT1表達(dá)水平和外周血T細(xì)胞亞群數(shù)量與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、4組患者外周血T細(xì)胞亞群的水平的比較

C組患者CD3+T細(xì)胞水平顯著低于A組，D組顯著低于B組(P<0.05)；D組患者CD4+T細(xì)胞水平顯著低于B、C組(P<0.05)，C組明顯低于A組(P<0.05)；CD8+T細(xì)胞水平在4組患者血清中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D組患者CD4+/CD8+比值顯著低于B組(P<0.05)；C組患者Treg細(xì)胞數(shù)量顯著高于A、B組(P<0.05)，D組顯著高于B組(P<0.05)，見表2。

表2 4組患者外周血T細(xì)胞亞群水平的比較

二、4組患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1、SCCA和CA125表達(dá)水平的比較

A組患者lncRNA NEAT1表達(dá)顯著高于B、C組，B、C組顯著高于D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)檢測患者血清中已知的、與宮頸癌診斷密切相關(guān)的SCCA及與上皮細(xì)胞病變相關(guān)的腫瘤表面抗原CA125的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，D組患者SCCA表達(dá)顯著高于A、B、C組(P<0.05)；D組患者CA125表達(dá)顯著高于A、B組(P<0.05)。見表3。

表3 4組患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1、SCCA、CA125表達(dá)水平的比較

三、患者血清lncRNA NEAT1和外周血T細(xì)胞亞群表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

宮頸癌患者血清lncRNA NEAT1水平與組織分化程度呈正相關(guān)(r=0.113，P<0.050)，與FIGO分期(r=-0.107，P<0.050)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.082，P<0.050)，與腫瘤直徑(r=-0.634，P>0.050)、浸潤深度無關(guān)(r=-0.095，P>0.050)。在宮頸癌患者外周血中，CD3+T細(xì)胞水平與組織分化程度呈正相關(guān)(r=0.801，P<0.050)；CD4+/CD8+與組織分化呈正相關(guān)(r=0.185，P<0.050)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.598，P<0.050)；Treg細(xì)胞與FIGO分期(r=0.564，P<0.050)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.517，P<0.050)，與組織分化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.729，P<0.050)，見表4。

表4 血清lncRNA NEAT1和外周血T細(xì)胞表達(dá)水平與臨床病理特征相關(guān)性

討 論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。在該病發(fā)展的長期病理過程中，從上皮內(nèi)瘤變連續(xù)演變成為宮頸癌，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)展的必要條件[9]。機(jī)會性篩查女性高危型HPV是否感染及宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是我國預(yù)防宮頸癌的重要手段，但對于已患宮頸癌的患者，目前尚缺乏有效的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物。臨床上主要采用SCCA輔助診斷鱗癌，但其診斷的敏感性和特異性有限，很難作為臨床精準(zhǔn)評估宮頸癌發(fā)展的參考指標(biāo)。絕大多數(shù)指南均已將腫瘤體積變化作為患者治療效果的最終評判依據(jù)，該方法有賴于超聲結(jié)合具體參數(shù)進(jìn)行最終判定[10-11]。目前臨床上缺乏系統(tǒng)、完善的宮頸癌血清學(xué)預(yù)后評估方案用于患者預(yù)后的快速評價(jià)。因此，本研究從生物組學(xué)角度出發(fā)，嘗試在宮頸癌患者的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物及T細(xì)胞亞群檢測方面進(jìn)行探索，來評估其在患者預(yù)后評估中的應(yīng)用價(jià)值。

lncRNA在多種腫瘤病理變化中發(fā)揮重要作用[12-13]。在宮頸病變的進(jìn)化演變，如細(xì)胞分化、發(fā)育等過程中l(wèi)ncRNA扮演了重要角色[14]。Shen等[15]研究顯示，lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié) miR-124/NF-κB通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，同時(shí)，宮頸癌組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究結(jié)果提示，A組患者lncRNA NEAT1表達(dá)水平顯著高于B、C組，同時(shí)B、C組顯著高于D組；血清lncRNA NEAT1水平與組織分化程度呈正相關(guān)，與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；D組患者SCCA含量高于其他3組，D組患者CA125表達(dá)顯著高于A、B組。隨著患者病情進(jìn)展，SCCA和CA125表達(dá)水平將明顯增高，因此其表達(dá)水平一定程度上表明了患者腫瘤病變的嚴(yán)重程度。患者血清中高表達(dá)lncRNA NEAT1提示宮頸癌預(yù)后較好，低表達(dá)lncRNA NEAT1提示組織分化不良及高淋巴轉(zhuǎn)移潛能。本研究結(jié)果與徐笑宇等[16]的報(bào)道相符，他們發(fā)現(xiàn)血清中l(wèi)ncRNA NEAT1在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者中表達(dá)降低，同時(shí)lncRNA NEAT1低表達(dá)提示宮頸癌患者組織分化程度差，并且lncRNA NEAT1術(shù)后水平明顯高于術(shù)前水平。

T細(xì)胞亞群主要包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞，其亞群和功能處于動態(tài)平衡。隨著宮頸病變的進(jìn)展，患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平會出現(xiàn)變化，且隨著病情加重，可能引發(fā)細(xì)胞免疫系統(tǒng)失衡現(xiàn)象，導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能削弱或喪失[17]。腫瘤篩查中檢測T淋巴細(xì)胞亞群，可為輔助檢查、預(yù)后評估等提供依據(jù)[18]。CD3+T細(xì)胞與機(jī)體免疫功能成正相關(guān)，當(dāng)CD3+T細(xì)胞水平降低時(shí)，機(jī)體的免疫功能同時(shí)也會變?nèi)?。本研究顯示CD3+T細(xì)胞水平A組顯著高于C組，B組高于D組，且CD3+T細(xì)胞水平與組織分化程度呈正相關(guān)，該結(jié)果提示低CD3+T細(xì)胞水平預(yù)示宮頸癌組織分化不良，機(jī)體免疫功能下降。宮頸癌患者機(jī)體免疫功能與正常人相比呈現(xiàn)降低的趨勢，不同分期的宮頸癌其免疫功能降低的程度是不同的，隨著宮頸癌臨床分期的進(jìn)展，機(jī)體免疫功能會呈現(xiàn)越來越嚴(yán)重的降低趨勢[19-20]。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫反應(yīng)調(diào)控中樞細(xì)胞，其水平降低會導(dǎo)致感染或者發(fā)生惡性腫瘤。我們的結(jié)果顯示宮頸癌患者血清中CD4+T細(xì)胞數(shù)量A組高于C組，B組顯著高于D組，提示低水平CD4+T細(xì)胞同樣預(yù)示宮頸癌組織分化不良。CD8+T細(xì)胞是具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞亞群，在免疫反應(yīng)中具有直接殺傷力，可清除被病原微生物感染的變異細(xì)胞[21]。本研究中CD8+T細(xì)胞在4組患者血清中表達(dá)無明顯差異，但D組患者CD4+/CD8+比值顯著低于B組，CD4+/CD8+與組織分化呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。說明宮頸癌進(jìn)展時(shí)CD8+T細(xì)胞數(shù)量增多，提示CD8+T細(xì)胞水平升高可能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫缺陷及宮頸癌低分化，導(dǎo)致預(yù)后不良。

Treg細(xì)胞通過分泌IL-10與TGF-β等抑制性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞以及競爭性結(jié)合IL-2等多種途徑抑制免疫細(xì)胞的功能，從而對CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的抗腫瘤效應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[22-24]。我們的結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量C組顯著高于A組，D組高于B組，且Treg細(xì)胞與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與組織分化呈負(fù)相關(guān)，說明Treg細(xì)胞數(shù)量與宮頸癌病情進(jìn)展的關(guān)系密切，外周血Treg細(xì)胞比例增加提示組織分化不良，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)水平可初步評估宮頸癌的進(jìn)展情況[24]。

綜上所述，通過對lncRNA NEAT1和T細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合檢測，低lncRNA NEAT1表達(dá)水平，同時(shí)低CD3+、CD4+T細(xì)胞水平、低CD4+/CD8+比值、高Treg細(xì)胞數(shù)提示宮頸癌組織分化低和癌細(xì)胞高淋巴轉(zhuǎn)移潛能。本研究有助于初步評估宮頸癌患者組織分化及是否有淋巴轉(zhuǎn)移等臨床預(yù)后情況，對制定術(shù)后治療方案具有一定的參考價(jià)值。但是本研究也有一定局限性，單因素研究僅闡釋了各項(xiàng)指標(biāo)可獨(dú)立用于患者臨床預(yù)后的判定，但是各指標(biāo)單獨(dú)使用時(shí)靈敏度、特異度如何，仍需進(jìn)一步探究。后續(xù)研究需要構(gòu)建模型進(jìn)行多因素回歸分析，多中心、大樣本進(jìn)一步分析各項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合用于宮頸癌患者預(yù)后評估的可能性。同時(shí)，本研究尚未進(jìn)行長時(shí)間隨訪，lncRNA NEAT1和T細(xì)胞對患者長遠(yuǎn)預(yù)后如何，仍待后續(xù)觀察。