鴨油甘油二酯與殼聚糖聯(lián)合應(yīng)用對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎修復(fù)的影響

王 茜 ，王寶維,*，葛文華，張名愛,，叢紅霞，徐慧心，孔 敏，凡文磊,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，山東青島 266109）

炎癥性腸?。↖BD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和Crohn ?。–D）[1]。潰瘍性結(jié)腸炎是一種非特異性結(jié)腸炎，其臨床表現(xiàn)包括腹痛、血便等[2]。近年來，人類和動物潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈上升趨勢，并伴有向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的風(fēng)險[3]，因此尋找安全修復(fù)方法具有重要意義。甘油二酯（DG）是油脂酶解的中間產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用[4]，具有抑制革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌[5]、刺激腸道脂質(zhì)代謝[6]等功能。目前，國外對于食品級DG 的研究剛剛起步，少數(shù)產(chǎn)品采用植物油制備。我國肉鴨每年屠宰約45 億只，屠宰產(chǎn)生了大量腹脂、皮脂等副產(chǎn)品，經(jīng)過加工提取和精煉，可獲得到大量鴨油，且價格低廉。本研究室采用鴨油成功制備DG[7]。目前，鴨油甘油二酯（DDG）與其他產(chǎn)品的功能性差異性及其在食品中的應(yīng)用技術(shù)還缺乏深入研究。Lin 等[8]試驗發(fā)現(xiàn)，富含脂質(zhì)的腸內(nèi)營養(yǎng)可以控制腸缺血再灌注損傷后的腸炎癥，改善腸運動性和黏膜屏障損傷。殼聚糖（CTS）是天然多糖甲殼素脫除部分乙?；漠a(chǎn)物，具有減少脂肪形成[9]、抑制細(xì)菌活性[10]等功能。Davydova 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高分子量CTS 可刺激小鼠血清中抗炎癥細(xì)胞IL-10 的合成，降低髓過氧化物酶（MPO）活性。目前，國內(nèi)外對殼聚糖抑菌方面的研究已有許多，而DDG 與CTS聯(lián)合使用對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的修復(fù)效果研究未見報道。因此，本文通過探究DDG 與CTS 聯(lián)合應(yīng)用對小鼠腸道炎癥屏障保護(hù)的效果，分析炎癥細(xì)胞因子含量的變化，旨在探索腸道健康的新型生物防護(hù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料配方 6 周齡雄性昆明系小鼠，體重為25～30 g，購自青島大任富城有限公司。DDG 為實驗室自制產(chǎn)品，純度達(dá)85%。CTS 購自山東奧康生物科技有限公司（MW：850 000 DA；脫乙酰度：96.1%；批號190416A），按照3%（w/w）的比例將CTS 溶解于1%（v/v）醋酸鹽水中，即CTS 溶液[12]。LD3020 硫酸葡聚糖（MW：50 000）購自合肥博美生物科技有限公司。飼料購于德州諾唯實生物技術(shù)有限公司，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 DDG 的制備方法[13]①將鴨油和水按1:1 放在87℃恒溫水浴鍋中1.5 h，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗除去下層溶液。②在油層中加入一倍的1 mol/L NaOH 溶液，87℃恒溫水解1.5 h。③加入一倍量的NaCl 洗滌除去甘油，調(diào)節(jié)pH 為2～3，釋放游離的脂肪酸。④將混合脂肪酸與甘油按照2.02:1 放入錐形瓶中混合，并加入1.65%固定化南極假絲酵母脂肪酶B，放置在恒溫?fù)u床54℃進(jìn)行酶解反應(yīng)。⑤反應(yīng)結(jié)束后，以2 500 r/min 離心15 min，將酶與底物分離，得到DDG。

1.3 試驗設(shè)計 試驗小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，保持室溫24～25℃，人工光照12 h/d，相對濕度40%～60%，試驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由飲食。按照《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）開展本項試驗。

1.3.1 結(jié)腸炎模型建立 參照Chassaing 等[14]的方法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。設(shè)計對照組與模型組，對照組和模型組組間差異采用獨立性T 檢驗分析，對照組5個重復(fù)，模型組20 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只。所有小鼠自由飲食，對照組小鼠自由飲用蒸餾水，模型組將葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶于蒸餾水中配制5%（w/v）的DSS溶液，替代飲用水，每天進(jìn)行更換，小鼠連續(xù)自由飲用7 d 誘發(fā)結(jié)腸炎，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。對照組與模型組各抽取25 只小鼠，禁食24 h，實施安樂死，收集血樣，檢測致炎因子，測量結(jié)腸長度，驗證模型建立是否成功。

1.3.2 結(jié)腸炎修復(fù)試驗 試驗設(shè)計正常對照組、炎癥模型組和炎癥修復(fù)組（Ⅰ～Ⅵ組），共8 個組。每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)5 只，共200 只小鼠。炎癥修復(fù)組采用2×3 兩因素交叉等重復(fù)的析因設(shè)計。正常對照組與炎癥模型組灌服4 mL/kg 生理鹽水，炎癥修復(fù)組分別灌服甘油二酯2、3、4 mL/kg 及殼聚糖溶液2、4 mL/kg，所有小鼠均飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗周期為3 周。具體飼喂情況如表2 所示。連續(xù)灌胃7 d 進(jìn)行修復(fù)治療后，對所有小鼠實施安樂死。

表2 試驗期小鼠分組處理情況

1.4 血清生化指標(biāo)的測定 在試驗結(jié)束時，眼球取血收集血樣，并在3 000 r/min 下離心20 min 獲得血清，并將其儲存在-40℃下。使用ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定血清中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）、MPO 含量。

1.5 結(jié)腸腸道組織學(xué)檢測 收集每只小鼠的結(jié)腸，測量結(jié)腸的長度和重量，然后切下結(jié)腸下段相同位置的長0.5 cm的結(jié)腸樣品，在10%中性福爾馬林中固定24 h 后，將結(jié)腸樣品用流水沖洗12 h 后分級酒精溶液脫水，進(jìn)行石蠟包埋切片，蘇木精和曙紅染色后通過生物顯微鏡觀察不同組之間的組織學(xué)變化，并通過數(shù)碼相機(jī)獲取圖像，采用LY-WN-HP SUPPER CCD 軟件測量結(jié)腸的絨毛高度和隱窩深度。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用 Excel 2016 進(jìn)行整理，利用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)腸炎模型建立階段對照組和模型組組間差異進(jìn)行獨立性t檢驗分析，結(jié)腸炎修復(fù)試驗階段，通過GLM 模型進(jìn)行2×3 因子分析，差異顯著者用 Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值和集合標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，P＜0.05 表示差異顯著，0.05 ≤P＜0.10表示有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSS 誘導(dǎo)潰瘍性腸炎模型的建立 如表3 可知，飼喂DSS 后，與對照組相比，模型組的體重變化及結(jié)腸長度均顯著降低，模型組TNF-α、IL-6 含量均顯著增加，表明DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功[14]。

表3 DSS 對小鼠造模的影響

2.2 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重修復(fù)、結(jié)腸長度和MPO 活性的影響 如表4 所示，DDG、CTS 對小鼠體重變化影響顯著；DDG 與CTS 交互對于體重變化作用極顯著，Ⅲ組體重變化分別較Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組高1.13%、1.78%、6.48%、5.33%、2.74%（P＜0.01）。DDG、CTS 對于小鼠結(jié)腸長度變化無顯著影響；DDG 與CTS 交互對于結(jié)腸長度作用不顯著。DDG 對MPO 活性影響極顯著；CTS 對MPO 活性變化有顯著影響；DDG 與CTS 交互對MPO 活性影響極顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的MPO 值無顯著差異，但顯著低于其他試驗組。

2.5 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞因子水平的影響 修復(fù)治療后，各組小鼠的生理指標(biāo)變化如表5，DDG 對IL-4、IL-17、IL-1β、IFN-γ濃度變化影響極顯著，對于IL-6、TNF-α濃度變化有顯著影響；CTS對IL-4、IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α濃度變化作用極顯著；Ⅲ組與Ⅴ組的TNF-α濃度無顯著差異，但顯著低于其他試驗組；Ⅲ組的IL-6、IL-17、IL-1β濃度均顯著低于其他各試驗組。DDG 與CTS 交互對IL-4、IL-6、TNF-α濃度的變化有顯著影響，DDG 與CTS 交互對于IL-17、IL-1β、IFN-γ濃度的變化作用極顯著。

綜上所述，經(jīng)過DDG 與CTS 聯(lián)合修復(fù)治療可降低結(jié)腸炎小鼠的炎癥反應(yīng)，減少炎性細(xì)胞因子的釋放。

2.6 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織發(fā)育的影響 如圖1 可知，正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜完整，隱窩腺體完整，無炎性細(xì)胞浸潤；與正常對照組相比，炎癥模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)較大潰瘍，隱窩結(jié)構(gòu)大部分消失，大量炎性細(xì)胞浸潤；與炎癥模型組相比，Ⅰ～Ⅵ組小鼠結(jié)腸黏膜較少缺損，隱窩腺體破壞較輕，炎性細(xì)胞較少。

如表6 所知，DDG 對于絨毛高度、線隱比變化作用極顯著，對于隱窩深度無顯著影響；殼聚糖可顯著增加絨毛高度，對隱窩深度與絨隱比無顯著影響；Ⅲ、Ⅳ組絨毛高度顯著高于其他試驗組，Ⅱ組、Ⅲ組的隱窩深度顯著低于Ⅵ組。Ⅲ組的絨隱比高于Ⅴ組、Ⅵ組；DDG 與CTS 交互對絨毛高度、隱窩深度的變化作用顯著，對于絨隱比的變化作用不顯著。

表4 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重變量、結(jié)腸長度和MPO 活性的影響

表5 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞因子的影響

圖1 各組結(jié)腸組織H&E 染色情況（×20）

表6 DDG 與CTS 聯(lián)合對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸發(fā)育的影響

綜上所述，對于結(jié)腸炎小鼠給予不同水平的DDG與CTS 進(jìn)行治療，可使結(jié)腸絨毛高度增大，隱窩深度變淺，絨隱比增大，促使小鼠腸道炎癥恢復(fù)，其中Ⅲ組修復(fù)治療效果最好。

3 討 論

3.1 DDG 與CTS 聯(lián)合對降低炎癥反應(yīng)的影響 潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥可能是巨噬細(xì)胞破壞結(jié)腸黏膜，導(dǎo)致免疫失調(diào)，癥狀為體重減輕、腹瀉、血便、結(jié)腸縮短等[15]，會導(dǎo)致MPO 含量增加，結(jié)腸中MPO 的積累為中性粒細(xì)胞進(jìn)入組織的標(biāo)志[16]。Park 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，富含中鏈脂肪酸-二酰甘油（MCDG）的食用油與常規(guī)使用的低芥酸菜籽油和橄欖油對照相比，MCDG 可抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用。Liu 等[18]通過研究CTS 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群和腸屏障功能的影響發(fā)現(xiàn)，CTS 通過增加體重和結(jié)腸長度等顯示出對結(jié)腸炎的治療效果。DG 對膽汁酸的分泌有抑制作用，可用于預(yù)防或治療腹瀉，可治療炎癥[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，結(jié)腸炎模型組小鼠體重顯著下降，結(jié)腸長度顯著縮短，這與腸炎造成腸道黏膜損傷、組織壞死、營養(yǎng)物質(zhì)吸收受阻有關(guān)。腸炎造成MPO 含量顯著增加，說明MPO 發(fā)揮了調(diào)控作用，通過催化氧化氯離子產(chǎn)生次氯酸在吞噬細(xì)胞內(nèi)殺滅微生物，破壞多種靶物質(zhì)，對調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面進(jìn)行干預(yù)。DDG 與CTS 修復(fù)治療后，能夠使小鼠體重上升，結(jié)腸長度增加，MPO 含量降低，表明腸道炎癥修復(fù)后，腸道組織發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)吸收恢復(fù)正常。DDG 與CTS 聯(lián)合具有降低炎癥反應(yīng)的協(xié)同作用。

3.2 DDG 與CTS 聯(lián)合對炎癥細(xì)胞因子水平的影響 CTS 具有抗菌、抗病毒、抗炎等廣泛的生物活性。Yousef 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，急性結(jié)腸炎小鼠接受CTS 治療后可抑制其結(jié)腸組織中的NF-κB 活化以及TNF-α和IL-6 水平；Yoon 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在增加CTS 濃度的情況下，可降低由革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖（LPS）誘導(dǎo)分泌在RAW 264.7 細(xì)胞孵育培養(yǎng)基中的TNF-1 和IL-6，說明CTS 具有抗炎作用。DG 是由丙三醇（甘油）與2 個脂肪酸酯化后得到的產(chǎn)物，是一種天然性油脂，具有抗炎、抑菌等作用。郭夏麗等[22]通過研究樟樹籽油甘油二酯的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，樟樹籽油甘油二酯對于革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用。Wendell 等[23]闡述了脂肪酸可在分解階段釋放大量H 離子，使炎癥細(xì)胞代謝衰竭，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而起到抗炎作用。核因子-κB（NF-κB）是調(diào)控炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，在創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。目前，治療潰瘍性結(jié)腸炎的手段主要有水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類藥物、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子抗體等，共同作用機(jī)制是調(diào)節(jié)和阻斷NF-κB/Rel 信號通路，從而減少炎性細(xì)胞因子的釋放，或抑制炎性細(xì)胞因子的作用，炎性細(xì)胞因子中 IL-6、IL-1β、TNF-α等均在轉(zhuǎn)錄水平上為NF-κB/Rel 所控制[24]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，結(jié)腸腸炎處理組各指標(biāo)均顯著升高，鴨油甘油二酯與殼聚糖以及交互對各指標(biāo)均作用顯著，表明鴨油甘油二酯與殼聚糖對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有一定的修復(fù)治療作用，可調(diào)節(jié)免疫紊亂。鴨油甘油二酯與殼聚糖對結(jié)腸炎的改善作用可能是通過抑制NF-κB 通路，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，其機(jī)理有待于繼續(xù)研究。

3.3 DDG 與CTS 聯(lián)合對結(jié)腸組織發(fā)育的影響 絨毛高度、隱窩深度及絨隱比是衡量腸黏膜完整的重要指標(biāo)[25]。馮俊等[26]在斷奶仔豬的基礎(chǔ)日糧中添加CTS 后發(fā)現(xiàn)，仔豬小腸絨毛高度呈升高趨勢；劉亞楠等[25]研究發(fā)現(xiàn)，不同水平的DDG 與維生素D3可顯著升高結(jié)腸炎大鼠的絨毛高度，降低隱窩深度。陳星等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎仔豬的十二指腸、回腸絨隱比顯著降低。本試驗發(fā)現(xiàn)，炎癥模型組結(jié)腸黏膜缺損，腺體不完整，絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增加，大量隱窩結(jié)構(gòu)破壞，絨隱比顯著降低，炎性細(xì)胞明顯浸潤。經(jīng)過DDG 與CTS 協(xié)同修復(fù)治療后，Ⅲ組小鼠修復(fù)效果對比于其他各組較好，結(jié)腸黏膜缺損較輕，炎性細(xì)胞較少，絨毛高度增加，少量隱窩腺體不完整，隱窩深度降低，絨隱比增加，且大于其他各組，表明DDG 與CTS 聯(lián)合可促進(jìn)小鼠結(jié)腸組織發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，DDG 與CTS 聯(lián)合可降低DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)，降低腸道炎癥因子水平，可改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠生理指標(biāo)，促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織發(fā)育，具有交互協(xié)同修復(fù)治療作用，是一種很有開發(fā)價值的腸道炎癥健康修復(fù)劑，其中3 mL/kg DDG與2 mL/kg CTS 組合對于小鼠結(jié)腸炎治療效果最佳。