重組豬胰蛋白酶在制備狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）中的應(yīng)用

顧玉林，牛彪，阮俊程，張亞靜，解麗霞，陳磊，蘇波，田大勇

上海青賽生物科技有限公司，上海201500

動物源性胰蛋白酶（簡稱胰酶）是從動物胰臟中分離純化獲得的，其作為重要的原料，在原代及傳代細(xì)胞基質(zhì)的制備過程中具有重要的作用。

目前，國內(nèi)生物制品企業(yè)使用的胰酶幾乎均為動物源性產(chǎn)品（豬源或牛源）。盡管該類產(chǎn)品的生產(chǎn)及質(zhì)控過程受到了嚴(yán)格的監(jiān)管［1-2］，但由于豬及牛均可攜帶數(shù)種人畜共患性病原［3-4］，因此，動物源性胰酶的使用仍對疫苗安全性具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)［5］。近年來發(fā)生了多起因動物源性胰酶的使用而造成生物制品被外源因子污染的案例［6-8］。如2010 年，葛蘭素史克（GSK）公司生產(chǎn)的口服輪狀病毒疫苗被檢測出含有Ⅰ型豬圓環(huán)病毒（porcine circovirusof type 1，PCV1）核酸成分，溯源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV1 可能來自疫苗生產(chǎn)使用的Vero 細(xì)胞庫，胰酶則成為重點(diǎn)懷疑對象［9］。盡管 PCV1 對人類無致病性［10-13］，但該事件仍然引起了人們對動物性產(chǎn)品使用的廣泛思考，并逐步認(rèn)識到用非動物源性產(chǎn)品替代動物源性原輔料是必然趨勢，對于進(jìn)一步提高人用生物制品安全具有重要的意義。

重組豬胰酶由基因工程菌生產(chǎn)，其氨基酸序列與豬胰腺來源的胰酶完全一致，特異性相同［14］。重組豬胰酶相對分子質(zhì)量約為24 000，最適工作pH為7 ～10。與動物源性胰酶相比，重組胰酶雜質(zhì)少，一般通過親和層析的方式純化，產(chǎn)品純度極高，幾乎不含雜蛋白成分；消化效果更好，因不含各種動物源性蛋白（尤其是糜蛋白酶等），不會對消化效果產(chǎn)生負(fù)面影響［14-15］；生產(chǎn)過程中不使用任何有活性的動物源性原輔料，無外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)。

本文研究了原核系統(tǒng)表達(dá)的重組豬胰酶在原代雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）制備過程中的最適工作濃度，并比較了狂犬病病毒在重組豬胰酶及豬胰酶消化的CEF 細(xì)胞中的病毒滴度。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及雞胚 狂犬病病毒Flurry HEP 株工作種子（滴度：7.0 lgCCID50／ mL，批號：20171001）及BSR 細(xì)胞（代次：P 45）均由上海青賽生物科技有限公司制備和保存；SPF 級雞胚（10 日齡，批號：2018-0810）購自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 重組豬胰酶（批號：RPT171-201）購自上海雅心生物技術(shù)有限公司；豬胰酶（批號：1957852）購自美國Gibco 公司；配方營養(yǎng)液培養(yǎng)基（批號：PD201808008）及胰酶兔源多克隆抗體（批號：20190318）為上海青賽生物科技有限公司自制；胎牛血清（批號：201803015）購自蘭州榮曄生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（批號：EZ241A400）購自德國BIOFROXX 公司；超敏ECL 發(fā)光試劑盒（批號：P0018S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；狂犬病病毒熒光抗體（批號：526056）購自美國FDI 公司；12% SDS-PAGE 預(yù)制膠（批號：1808170）及 DMEM培養(yǎng)基（批號：2004656）購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；HRP-羊抗兔 IgG 抗體（批號：BST13C23C55）購自武漢博士德生物工程有限公司；PVDF 膜（批號：1620177）及蛋白電泳儀購自美國BIO-RAD 公司；BIO-5000Plus 凝膠掃描儀購自上海中晶科技有限公司；Amersham Imager680 發(fā)光成像儀購自美國GE 公司；R1 全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自日本OLYMPVS公司。

1.3 重組豬胰酶及豬胰酶樣品分析鑒定 采用SDSPAGE 及Western blot 法。分別取豬胰酶及重組豬胰酶檢測樣品2 μL，用預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，去離子水脫色過夜；凝膠掃描儀拍圖，使用Image J 軟件分析豬胰酶及重組豬胰酶蛋白條帶的灰度值，并計(jì)算胰酶蛋白條帶占總蛋白條帶的比例。電泳完成后，將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，放入含1%牛血清白蛋白的TBST 中，4 ℃，30 r ／ min 水平搖床封閉過夜；加入胰酶兔源多克隆抗體（1 ∶2 000 稀釋），常溫 30 r ／ min 水平搖床上孵育 2 h；TBST 洗滌 3 次，10 min ／ 次，加入 HRP-羊抗兔 IgG 抗體（1 ∶3 000 稀釋），常溫 30 r ／ min 水平搖床孵育 45 min；TBST 洗滌 3 次，15 min ／ 次，加入超敏ECL 發(fā)光試劑，曝光檢測結(jié)果。

1.4 消化原代CEF 的重組豬胰酶最適工作濃度篩選基于豬胰酶消化制備原代CEF 成熟的方法。用PBS配制豬胰酶濃度為1.25 mg ／ mL，重組豬胰酶濃度分別為 1、0.25、0.062 5 和 0.015 625 mg ／ mL。取活性良好的10 日齡雞胚25 枚，胚胎用PBS 清洗3次，用剪刀將胚胎剪碎成2 ～3 mm 組織塊，分別加入不同濃度的重組豬胰酶及豬胰酶，搖勻，置37 ℃水浴消化16 min（期間輕輕搖晃1 次）；加入終濃度10%胎牛血清終止消化，棄上清液；PBS 洗滌2次，吸管輕輕吹打消化后的組織塊，至全部形成單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液用細(xì)胞生長液定容至400 mL，過濾后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞活率。將上述細(xì)胞懸液分裝至 T75 細(xì)胞瓶（30 mL ／ 瓶），每個(gè)消化濃度分裝 3瓶，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后換液及拍照；48 h 后各取 1 瓶，用 2.5 mg ／ mL 豬胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖比；其余細(xì)胞瓶繼續(xù)培養(yǎng)至96 h 拍照，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 重組豬胰酶對狂犬病病毒滴度影響的檢測 分別用0.062 5 mg ／ mL 重組豬胰酶及 1.25 mg ／ mL豬胰酶按1.4 項(xiàng)方法消化原代CEF；分別將2 種細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1.2×106和1.7×106個(gè)／mL，以MOI = 0.01 懸浮接種狂犬病病毒Flurry HEP 株工作種子，混勻后分裝至 T225 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，80 mL ／ 瓶，34 ℃培養(yǎng)24 h；換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于換液后 24、48、72、96、120、144 及 168 h 取樣，0.5 mL ／次，采用直接熒光免疫染色法檢測病毒滴度。將病毒樣品用DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行10 倍系列稀釋至1 ×10-6倍；每個(gè)稀釋度取 10 μL 加入 96 微孔板中，每個(gè)稀釋度接種6 個(gè)復(fù)孔。加入已消化制成的（1.5 ～2.5）× 105個(gè) ／ mL BSR 細(xì)胞懸液，90 μL ／ 孔，置34 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h；取出 96 微孔板加入丙酮，100 μL ／ 孔，靜置 1 min 后傾倒，再加入丙酮，200 μL ／ 孔，-20 ℃凍存 1 h；PBS 洗滌 3 次，加入狂犬病病毒熒光抗體，50 μL ／ 孔，37 ℃孵育 1 h；PBS 洗滌3 次。熒光顯微鏡下觀察并記錄陽性孔數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組豬胰酶及豬胰酶樣品分析鑒定 經(jīng)12%SDS-PAGE 及Western blot 分析，豬胰酶含有多條低于相對分子質(zhì)量15 000 的蛋白條帶，重組豬胰酶僅含1 條介于相對分子質(zhì)量20 000 ～25 000 的蛋白條帶，見圖1。豬源胰酶及重組豬胰酶樣品中胰酶占總蛋白的比例分別為33%和100%，表明重組豬胰酶的純度更高。

2.2 消化原代CEF 的最適重組豬胰酶濃度 結(jié)果顯示，隨著重組豬胰酶濃度的降低，原代CEF 細(xì)胞的活率逐步升高；與1.25 mg ／ mL 豬胰酶比較，豬胰酶濃度為 0.062 5 mg ／ mL 時(shí)，CEF 細(xì)胞活率、單胚細(xì)胞收獲量及體外培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞增殖比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為 1.41、0.78 和 0.55，P 分別為 0.23、0.48 和 0.61）。見圖 2 ～ 4。顯微鏡觀察顯示，培養(yǎng) 96 h 后，濃度為 1 及 0.25 mg ／ mL 重組豬胰酶消化的原代CEF 出現(xiàn)明顯的脫落或拉網(wǎng)，濃度0.062 5 及 0.015 625 mg ／ mL 消化的 CEF 細(xì)胞表現(xiàn)為纖維拉伸及形態(tài)正常，均與1.25 mg ／ mL 豬胰酶消化的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯變化，見圖5。選擇重組豬胰酶最適工作濃度為0.062 5 mg ／ mL。

圖2 重組豬胰酶及豬胰酶消化后CEF 細(xì)胞活率Fig.2 Viabilities of CEFs digested with recombinant porcine trypsin and with porcine trypsin

2.3 重組豬胰酶對狂犬病病毒滴度的影響 結(jié)果顯示，狂犬病病毒在2 種胰酶制備的原代CEF 中的生長特性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.11，P = 0.35），病毒滴度均在換液后96 h 達(dá)到峰值后迅速下降；CEF 濃度為 1.2 × 106個(gè) ／ mL 組換液 96 h 后，重組胰酶制備的細(xì)胞的病毒滴度略高于豬源胰酶制備的細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.0，P ＞ 0.05）。見圖6。

圖3 重組豬胰酶及豬胰酶消化后單胚細(xì)胞收獲量Fig.3 Yield of CEFs in a single embryo digested with recombinant porcine trypsin and with porcine trypsin

圖4 重組豬胰酶及豬胰酶消化48 h CEF 的增殖比Fig.4 Proliferation ratios of CEFs digested with recombinant porcine trypsin and with porcine trypsin

圖5 重組豬胰酶及豬胰酶消化后CEF 細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察（標(biāo)尺：800 μm）Fig.5 Microscopy of CEFs digested with recombinant porcine trypsin and with porcine trypsin（bar = 800 μm）

圖 6 重組豬胰酶及豬胰酶制備的 1.2 × 106 個(gè) ／ mL（A）和 1.7 × 106 個(gè) ／ mL（B）CEF 的狂犬病病毒滴度Fig.6 Rabies virus titers in CEFs at concentrations of 1.2 × 106 cells ／ mL（A）and 1.7 × 106 cells ／ mL（B）digested with recombinant porcine trypsin and with porcine trypsin

3 討 論

重組豬胰酶中幾乎無雜蛋白成分，酶活性更高，其工作濃度遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的豬源胰酶。在消化CEF的過程中，胰酶的實(shí)際使用量極大的減少，更利于胰酶殘留指標(biāo)的控制，對提高狂犬病疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量具有積極意義。

盡管目前重組豬胰酶在原代CEF 制備方面的成本遠(yuǎn)高于豬胰酶，但由于胰酶在狂犬病疫苗（CEF 細(xì)胞）的總成本中所占比例極小，使用重組胰酶并不會顯著增加疫苗成本及企業(yè)負(fù)擔(dān)。隨著企業(yè)對重組豬胰酶需求量增加，重組豬胰酶的產(chǎn)能和生產(chǎn)工藝定會逐步提高和完善，重組豬胰酶價(jià)格下降也是必然趨勢。

WHO 在生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會第65 號報(bào)告中指出，重組胰酶可用且應(yīng)該被推薦使用［16］?！吨袊幍洹啡浚?015）版和《歐洲藥典》8.0 版也明確要求，動物源胰酶用于疫苗生產(chǎn)時(shí)，需檢測胰酶相關(guān)的外源性病毒，包括豬細(xì)小病毒、牛細(xì)小病毒、PCV等［5，17-18］。因檢測方法靈敏度的限制，目前不能完全消除外源性病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。而對于用動物源胰酶作為原料生產(chǎn)的減毒活疫苗，由于最終產(chǎn)品未經(jīng)滅活工藝處理，外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)始終不能忽視。

重組胰酶或許應(yīng)在減毒活疫苗生產(chǎn)中先行推廣，并逐步全面應(yīng)用到基于組織培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)過程中。本研究為重組豬胰酶在狂犬病疫苗（CEF 細(xì)胞）生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。