基于PAK6和Wnt/β-catenin信號通路的苦參堿對肺癌放療敏感性的影響研究

李修煒，王記南，張 健

基于PAK6和Wnt/β-catenin信號通路的苦參堿對肺癌放療敏感性的影響研究

李修煒，王記南，張 健

周口市中心醫(yī)院 放療科，河南 周口 466000

探究苦參堿對肺癌放療敏感性的影響和作用機制。人非小細胞肺癌A549細胞分為對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿組、苦參堿聯(lián)合2 Gy組、苦參堿聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合4 Gy組，通過克隆形成、細胞增殖、細胞凋亡評價苦參堿對A549細胞放療敏感性的影響；建立裸鼠皮下移植瘤模型，分為對照組、5 Gy放療組、苦參堿組、苦參堿聯(lián)合5 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合5 Gy組，記錄小鼠瘤體積；Western blotting法檢測A549細胞和小鼠瘤組織中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、p21激活蛋白激酶6（p21-activated protein kinase，PAK6）、c-myc、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達。與單獨放療組相比，苦參堿聯(lián)合放療組A549細胞克隆形成、細胞增殖顯著降低（＜0.001），細胞凋亡顯著增加（＜0.001），裸鼠腫瘤體積顯著降低（＜0.001），細胞和裸鼠腫瘤組織中PAK6、c-myc、磷酸化β-catenin蛋白表達顯著下調(diào)（＜0.05、0.01、0.001），Caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)（＜0.001）。苦參堿通過干擾PAK6表達，抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路，從而提高肺癌的放療敏感性。

肺癌；苦參堿；p21激活蛋白激酶6；Wnt/β-catenin信號通路；放療敏感性

肺癌作為癌癥之首，患者生存率僅15%，根據(jù)組織學差異將其分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，非小細胞肺癌又分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌[1]。肺癌早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時已發(fā)展為中晚期，預(yù)后較差[2]。目前肺癌的治療方式主要為手術(shù)治療和放療，約65%非小細胞肺癌患者需要進行放療來提高治療效果，但長期的放療會產(chǎn)生放療敏感性降低、組織損傷等不良反應(yīng)[3]，因此選擇科學合理的用藥方式聯(lián)合放療以提高放療的敏感性，對肺癌的臨床治療至關(guān)重要。

苦參堿是從豆科槐屬植物苦參Alt. 中提取到的生物堿，對腫瘤有顯著的治療效果[4-6]。研究表明，苦參堿不僅可以抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，還能夠提高胃癌、乳腺癌等癌癥的放療敏感性[7-11]。苦參堿對肺癌放療的作用及機制尚不明確，本研究通過考察苦參堿對肺癌放療的影響和機制，為肺癌的臨床治療提供參考。

1 材料與儀器

1.1 細胞

人非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究所。

1.2 動物

SPF級Balb/c雌性裸鼠25只，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自鄭州大學實驗動物中心，合格證號SYXK（豫）2018-0004，飼養(yǎng)于恒溫恒濕12 h晝夜交替的SPF級動物房內(nèi)。所有動物實驗遵循周口市中心醫(yī)院有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 藥品與試劑

苦參堿（批號519-02-8，質(zhì)量分數(shù)98%）購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；甘氨雙唑鈉（批號201205284，質(zhì)量分數(shù)95.0%）購自山東綠葉制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、MTT檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司；p21激活蛋白激酶6（p21-activated protein kinase，PAK6）抗體、半胱氨酸蛋白酶3（Casepase-3）抗體、c-myc抗體、磷酸化β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、β-catenin抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG抗體均購自美國CST公司。

1.4 儀器

酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；23Ex醫(yī)用高能電子直線加速器（美國Varian公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）；電子顯微鏡（日本Nikon公司）；電泳儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將于液氮保存的A549細胞于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長至融合率達80%時進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 苦參堿對A549細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞，以4×103/孔接種于96孔板，設(shè)置對照組和苦參堿（2、4、8 μmol/L，苦參堿以DMEM培養(yǎng)基溶解）組。細胞貼壁后，更換為含不同濃度苦參堿的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液孵育4 h，加入200 μL DMSO，采用酶標儀于490 nm處測定吸光度（）。

2.3 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的A549細胞以4×103/孔接種于96孔板，設(shè)置對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿（4 μmol/L）組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合2 Gy組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合4 Gy組?？鄥A、甘氨雙唑鈉分別以DMEM培養(yǎng)基溶解，細胞貼壁后對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，各給藥組更換為含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，各放療組經(jīng)2、4 Gy的電離輻射后，每孔加入20 μL MTT溶液孵育4 h，加入200 μL DMSO，采用酶標儀于490 nm處測定。

電離輻射條件：美國Varian 23Ex醫(yī)用高能電子直線加速器，6 MV X射線，照射時細胞培養(yǎng)皿覆蓋2 cm厚的有機玻璃板，照射源距離為100 cm，劑量率為3.2 Gy/min。

2.4 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞克隆形成的影響

將處于對數(shù)生長期的A549細胞以3×102/孔的密度接種于6孔板中，設(shè)置對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿（4 μmol/L）組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合2 Gy組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合4 Gy組?？鄥A、甘氨雙唑鈉分別以DMEM培養(yǎng)基溶解，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，各放療組用2、4 Gy的X線照射，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～20 d，每7天更換1次培養(yǎng)基。當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，于無水乙醇固定30 min，加入1 mL 0.01%結(jié)晶紫孵育1 h，棄去染色液，清洗后于顯微鏡下統(tǒng)計單克隆集落數(shù)，計算集落形成率。

集落形成率（PE）＝集落數(shù)/接種細胞數(shù)

2.5 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞凋亡的影響

將處于對數(shù)生長期的A549細胞以5×105/孔接種于6孔板中，設(shè)置對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿（4 μmol/L）組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合2 Gy組、苦參堿（4 μmol/L）聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 μg/mL）聯(lián)合4 Gy組?？鄥A、甘氨雙唑鈉分別以DMEM培養(yǎng)基溶解，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，各放療組用2、4 Gy的X線照射。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取5×105個細胞于離心管中，加入500 μL Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FLTC、5 μL PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設(shè)置Annexin V-FLTC和PI單陽性組用于調(diào)節(jié)熒光補償，空白組用于調(diào)電壓。采用流式細胞儀檢測樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數(shù)。

2.6 苦參堿聯(lián)合放療對裸鼠皮下移植瘤模型的影響

根據(jù)預(yù)實驗和文獻報道[11-12]，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、5 Gy放療組、苦參堿（50 mg/kg）組、苦參堿（50 mg/kg）聯(lián)合5 Gy組、甘氨雙唑鈉（25 mg/kg）聯(lián)合5 Gy組，每組5只。收集處于對數(shù)生長期的A549細胞，以PBS重懸，調(diào)整細胞密度為1×108/mL；75%乙醇溶液消毒小鼠左側(cè)腋下，于裸鼠左側(cè)腋下sc 100 μL A549細胞。苦參堿、甘氨雙唑鈉溶于生理鹽水，當裸鼠腫瘤體積達100 mm3時，小鼠每2天ig 100 μL相應(yīng)藥物，對照組ig等體積生理鹽水；放療組小鼠每3天放療1次。治療期間隔天測量并計算瘤體積，給藥3周后，小鼠脫頸椎處死，取腫瘤組織。

2.7 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞和腫瘤組織中PAK6、Casepase-3、c-myc、β-catenin蛋白表達的影響

取腫瘤組織50 mg于離心管中，加入250 μL RIPA蛋白裂解液和2.5 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，冰上勻漿后12 000×、4 ℃離心10 min，取上清，即為組織總蛋白。取經(jīng)苦參堿聯(lián)合放療后的A549細胞，加入200 μL RIPA蛋白裂解液和2 μL PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解后12 000×、4 ℃離心10 min，取上清，即為細胞總蛋白。

BCA蛋白定量后于沸水浴加熱變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入PAK6、Casepase-3、c-myc、磷酸化β-catenin、β-catenin、GAPDH抗體（1∶1000）于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗，于室溫孵育1.5 h，TBST洗滌后按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)0.5 min，曝光并拍照，用Image J軟件進行分析。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對A549細胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組相比，苦參堿（2、4、8 μmol/L）組作用24、48、72 h后，A549細胞活力均顯著下降（＜0.001），說明苦參堿能夠有效抑制A549細胞增殖。結(jié)合文獻報道[9]，選擇中劑量4 μmol/L苦參堿進行后續(xù)實驗。

3.2 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞增殖的影響

如圖2所示，與對照組相比，除2 Gy放療組外，其余各組細胞活力均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；與2 Gy放療組相比，2 Gy放療聯(lián)合苦參堿、2 Gy放療聯(lián)合甘氨雙唑鈉組細胞活力顯著降低（＜0.001）；與4 Gy放療組相比，4 Gy放療聯(lián)合苦參堿、4 Gy放療聯(lián)合甘氨雙唑鈉組細胞活力顯著降低（＜0.001）；與甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組相比，苦參堿聯(lián)合放療組細胞活力無顯著差異。表明苦參堿能夠增加A549細胞放療的敏感性，與放療增敏劑甘氨雙唑鈉效果相當。

與對照組比較：***P＜0.001

3.3 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞克隆形成的影響

如圖3所示，對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿組、苦參堿聯(lián)合2 Gy組、苦參堿聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合4 Gy組細胞克隆形成率分別為（59.36±2.29）%、（58.67±1.13）%、（34.06±2.30）%、（38.09±1.08）%、（26.33±0.87）%、（19.04±1.18）%、（24.42±3.19）%（16.34±1.97）%。與對照組相比，除2 Gy放療組外，其余各組細胞克隆形成率均顯著降低（＜0.001）；與2、4 Gy放療組比較，苦參堿聯(lián)合放療、甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組細胞克隆形成率顯著降低（＜0.001）；苦參堿聯(lián)合放療組與甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組細胞克隆形成率無顯著差異。表明苦參堿能夠顯著提高A549細胞的體外放療敏感性。

3.4 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞凋亡的影響

如圖4所示，對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、苦參堿組、苦參堿聯(lián)合2 Gy組、苦參堿聯(lián)合4 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合2 Gy組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合4 Gy組細胞凋亡率分別為（4.28±1.07）%、（4.07±0.43）%、（6.20±0.20）%、（6.11±1.34）%、（12.93±2.06）%、（29.33±1.15）%、（14.06±0.27）%、（27.43±2.11）%。與對照組相比，除2 Gy放療組外，其余各組細胞凋亡率均顯著升高（＜0.05、0.001）；與2 Gy、4 Gy放療組比較，苦參堿聯(lián)合放療、甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組細胞凋亡率顯著升高（＜0.001）；苦參堿聯(lián)合放療組與甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組細胞凋亡率無顯著差異。表明苦參堿聯(lián)合放療能夠顯著增加細胞的放療敏感性。

3.5 苦參堿聯(lián)合放療對裸鼠皮下移植瘤的影響

如圖5所示，與對照組比較，各組裸鼠瘤體積均顯著降低（＜0.01、0.001）；與5 Gy放療組比較，5 Gy聯(lián)合苦參堿組和5 Gy聯(lián)合甘氨雙唑鈉組裸鼠瘤體積均顯著降低（＜0.001），表明苦參堿能夠顯著增加裸鼠肺癌放療敏感性。

3.6 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞和腫瘤組織中PAK6、Casepase-3、c-myc、β-catenin蛋白表達的影響

如圖6所示，A549細胞中，與對照組比較，除2 Gy放療組中僅c-myc蛋白表達顯著降低外（＜0.001），其余各組PAK6、c-myc、磷酸化β-catenin蛋白表達均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），Caspase-3蛋白表達顯著升高（＜0.01、0.001）；與2、4 Gy放療組比較，苦參堿聯(lián)合放療組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組PAK6、c-myc、磷酸化β-catenin顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），Caspase-3蛋白表達顯著升高（＜0.01、0.001），表明苦參堿能夠下調(diào)A549細胞PAK6表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路，促進細胞凋亡。

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與2 Gy組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與4 Gy組比較：aaa＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;#< 0.05##< 0.01###< 0.0012 Gy group;aaa< 0.0014 Gy group

圖6 苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞PAK6、Caspase-3、β-catenin、c-myc蛋白表達的影響

Fig. 6 Effect of matrine combined with radiotherapy on expressions of PAK6, Caspase-3, β-catenin and c-myc in A549 cells

如圖7所示，皮下移植瘤裸鼠中，與對照組比較，各組PAK6、c-myc、磷酸化β-catenin蛋白表達均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），苦參堿聯(lián)合放療組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組Caspase-3蛋白表達顯著升高（＜0.001）；與5 Gy放療組比較，苦參堿聯(lián)合放療組、甘氨雙唑鈉聯(lián)合放療組PAK6、c-myc、磷酸化β-catenin顯著降低（＜0.001），Caspase-3蛋白表達顯著升高（＜0.001），表明苦參堿能夠下調(diào)裸鼠皮下移植瘤模型PAK6表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與5 Gy組比較：###P＜0.001

4 討論

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其主要治療方式為手術(shù)和放療，雖然目前較先進的三維立體放療技術(shù)可以顯著提高放療的效果，但放療敏感性問題仍未得到解決[13]。增加放療頻率和劑量是提高腫瘤放療敏感性的主要手段，但其造成的嚴重肺損傷不利于患者的預(yù)后[14]。中藥復(fù)合物、中藥單體等用于腫瘤具有治療效果良好、不良反應(yīng)小等特點，因此越來越多的研究集中在中藥聯(lián)合放療治療腫瘤?？鄥A是從豆科槐屬植物苦參中提取到的生物堿，可有效抑制腫瘤的增殖和遷移，但其聯(lián)合放療治療肺癌尚未有明確的研究。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿聯(lián)合放療對A549細胞的增殖、克隆形成的抑制作用和對細胞凋亡的促進作用顯著優(yōu)于單獨放療；與單獨放療相比，苦參堿聯(lián)合放療可顯著抑制裸鼠皮下移植瘤模型腫瘤的生長，表明苦參堿可提高放療的治療效果，增加放療的敏感性。

PAK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調(diào)控細胞形態(tài)維持、骨架支撐等[15]。研究表明，PAK6在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌癥中高表達，可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)放療后A549細胞中PAK6蛋白表達顯著降低；苦參堿聯(lián)合放療后PAK6蛋白表達下調(diào)更加顯著，表明苦參堿能夠下調(diào)肺癌細胞PAK6蛋白表達，從而提高放療的敏感性。細胞凋亡是一個復(fù)雜的細胞程序性死亡的過程，由細胞內(nèi)多種基因共同調(diào)控。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，是細胞凋亡的執(zhí)行因子，Caspase-3活化后，酶切Caspase-3表達升高，細胞凋亡進入不可逆階段。研究表明，干擾腫瘤細胞PAK6的表達可促進凋亡蛋白Caspase-3表達[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿聯(lián)合放療可顯著增加Caspase-3蛋白表達，提示苦參堿可能通過抑制PAK6表達，促進Caspase-3表達，進而促進細胞凋亡。Wnt/β-catenin信號通路是腫瘤細胞內(nèi)經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，病理條件狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號通路激活，β-catenin與其他蛋白分子結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控相關(guān)蛋白的表達，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。c-myc是Wnt信號通路下游的靶基因，調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達。PAK家族蛋白與Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關(guān)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)與單獨放療相比，苦參堿聯(lián)合放療能夠顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路和下游c-myc的激活。

綜上所述，苦參堿能夠提高肺癌的放療敏感性，其機制可能與抑制PAK6表達和Wnt/β-catenin信號通路，進而調(diào)控腫瘤細胞的生長和凋亡有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Sensitivity of matrine to radiotherapy for lung cancer based on PAK6 and Wnt/β-catenin signaling pathways

LI Xiu-wei, WANG Ji-nan, ZHANG Jian

Radiotherapy Department of Zhoukou Central Hospital, Zhoukou 466000, China

To explore the effect and mechanism of matrine on radiosensitivity of lung cancer.Human non- small cell lung cancer A549 cells were divided into control group, 2 Gy radiotherapy group, 4 Gy radiotherapy group, matrine group, matrine combined with 2 Gy group, matrine combined with 4 Gy group, glycinazole sodium combined with 2 Gy group and glycinazole sodium combined with 4 Gy group; Clonal formation, cell proliferation, apoptosis were used to evaluate the effect of matrine on radiosensitivity of A549 cells. Subcutaneous transplantation tumor model in nude mice was established, which were divided into control group, 5 Gy radiotherapy group, matrine group, matrine combined with 5 Gy radiotherapy group, glycinazole sodium combined with 5 Gy radiotherapy group, tumor volume of mice were recorded; Western blotting was used to detect the expressions of β-catenin, p21-activated protein kinase (PAK6), c-myc and Caspase-3.Compared with radiotherapy group, the cell maturation and proliferation were significantly reduced (< 0.001), cell apoptosis was significantly increased (< 0.001), tumor volume of nude mice was reduced (< 0.001), the expressions of PAK6, c-myc and phosphorylation-β-catenin on A549 cells and tumor tissues were significantly downregulated (< 0.05, 0.01, 0.001), the expression of Caspase-3 was significantly increased (< 0.001) in matrine combined with radiotherapy group.Matrine could improve radiosensitivity of lung cancer through inhibiting the expression of PAK6 and Wnt/β-catenin signaling pathway.

lung cancer; matrine; PAK6; Wnt/β-catenin signaling pathway; radiotherapy sensitivity

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0447 -07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.018

2020-06-20

河南省科技攻關(guān)項目（116108351126）

李修煒，碩士，主治醫(yī)師，從事腫瘤相關(guān)研究。Tel: 18736236899 E-mail: lixiuwei1984@126.com

[責任編輯 李亞楠]