體外偶聯(lián)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶高效催化合成萊鮑迪苷A

朱清娟，陳美琪，梁書利，王登剛，林影

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

甜菊糖是從甜葉菊葉子中提取和純化的二萜糖苷，具有高甜度、低熱量、對人體無副作用等優(yōu)點(diǎn)[1]，美國食品和藥品管理局在 2008年將其列入為一般認(rèn)為安全（Generally Recognized As Safe，GRAS）的甜味劑[2]，其中甜菊苷（Stevioside，ST）和萊鮑迪苷A（Rebaudioside A）是甜菊糖含量最豐富的兩種成分，分別占干葉重的5%～10%和2%～4%。甜菊苷ST在甜菊糖中含量最高且甜度是蔗糖的250～300倍，但其具有較嚴(yán)重的苦澀余味，從而限制了其在食品和藥品中的消費(fèi)和應(yīng)用。然而萊鮑迪苷A（rebaudioside A，RA）除了具有高甜度、低熱量（熱值僅為蔗糖的1/300）、對人體無副作用等優(yōu)點(diǎn)外，而且口味純正，沒有后苦味[3]。因此可以作為天然甜味劑在食品和飲料行業(yè)廣泛應(yīng)用[4]，同時不會因長期食用使血糖濃度增加，可以有效預(yù)防肥胖癥、糖尿病、高血壓、苯丙酮尿癥等病癥[5]。目前制備高純度萊鮑迪苷A產(chǎn)品的方法主要包括培育高產(chǎn)萊鮑迪苷A的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結(jié)晶提純?nèi)R鮑迪苷A和環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶等酶對甜菊糖進(jìn)行改性等[6-9]，但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點(diǎn)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases，GTs）類中存在 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1能特異性地催化甜菊苷通過一步糖基化反應(yīng)合成萊鮑迪苷 A[10]。然而，甜葉菊中天然UGT76G1含量甚微，分離純化成本高，難以獲取大量的酶蛋白，并且糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中需要昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）作為糖基供體[11,12]，必然導(dǎo)致RA苷酶促合成應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性差，解決糖基化反應(yīng)過程中糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及底物UDPG昂貴的問題是提高RA生產(chǎn)效益的主要方法。

蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SuSy）催化可逆的葡萄糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通過蔗糖合成酶催化蔗糖和UDP產(chǎn)生UDP-葡萄糖，有效地為UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶提供了UDP-糖的需求[13,14]。在偶聯(lián)蔗糖合成酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建的級反應(yīng)體系，產(chǎn)生 UDP循環(huán)，實(shí)現(xiàn) UDP-葡萄糖的再生已成為糖基化生產(chǎn)權(quán)宜的供體[15]，已知的兩類蔗糖合成酶，分別來源于植物和細(xì)菌，通常來源于細(xì)菌的蔗糖合成酶對ADP有高的親和力，而對UDP親和力相對低，植物蔗糖酶對UDP的親和力高[16]。最近的研究發(fā)現(xiàn)選擇細(xì)菌來源的蔗糖合成酶耐熱穩(wěn)定性、比酶活和重組酶表達(dá)水平明顯高于植物來源的酶，因此其工業(yè)化應(yīng)用前景引起了人們極大的興趣。目前已有研究者在畢赤酵母中共表達(dá) UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和擬南芥來源的AtSUS這兩個酶基因在細(xì)胞體內(nèi)全細(xì)胞催化ST轉(zhuǎn)化為RA，其中唐小雁等以10 mg/mL的ST為底物合成為7.46 mg/mL的RA，RA的收率為74.60%[17]。同時也有研究者在大腸桿菌宿主菌中結(jié)合來自 rebaudiana的重組 UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT76G1和來自擬南芥的蔗糖合酶AtSUS1的活性，外源添加2.40 mM甜菊糖苷，7.20 mM蔗糖和0.006 mM UDP反應(yīng)30 h，萊鮑迪苷A的收率為78.21%[18]，此前報道的釀酒酵母中利用UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1將ST轉(zhuǎn)化為RA，其中劉歡等以1 g/L的ST為底物合成267.89 mg/L[19]。

本研究分別構(gòu)建了表達(dá)高活性 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和綠豆來源的蔗糖合成酶mbSUS的重組畢赤酵母菌株。通過發(fā)酵產(chǎn)酶，制備 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mbSUS，建立級聯(lián)酶催化反應(yīng)體系合成RA，實(shí)現(xiàn)UDPG在生物催化反應(yīng)中的循環(huán)，如圖1所示。此外，進(jìn)一步探究生物催化體系中，兩種酶不同的酶活配比量對RA合成的影響，確定了此級聯(lián)反應(yīng)中的限速酶和最適酶活配比，為RA酶法生物合成及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支持。

圖1 UGT76G1和蔗糖合成酶級聯(lián)反應(yīng)催化體系Fig.1 Process of catalytic synthesis of RA

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

宿主菌菌株（E.coli Top）10F”，（Pichia pastoris）GS115以及質(zhì)粒pPICZA由本實(shí)驗(yàn)室保存。畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K，購買自 Invitrogen公司。質(zhì)粒pUC57-mbSUS和質(zhì)粒pUC57-UGT76G1，帶已通過畢赤酵母密碼子優(yōu)化后的基因mbSUS和UGT76G1。這兩個優(yōu)化基因由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成。

1.1.2 工具酶與試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、SalI和MssI購自寶生物工程（大連）有限公司；高保真、高效率擴(kuò)增目的基因片段的KOD-Plus-Neo DNA聚合酶，購買自東洋紡（上海）生物科技有限公司。質(zhì)粒小量制備試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；PCR純化試劑盒購Magen（美基）生物有限公司；甜菊苷、萊鮑迪苷A由曲阜海根甜菊制品有限公司提供；UDP，UDPG購買自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LBL平板培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，0.5% NaCl，1.5%的瓊脂粉，根據(jù)需要添加zeocin使終濃度為 100 mg/mL。YPD平板培養(yǎng)基：1.34%YNB；0.4 mg/L生物素；2%葡萄糖，1.5%的瓊脂粉。YPD（含 Zeocin）平板：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，100 μg/mL Zeocin，MD 平板：1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，(4×10-5)% Biotin. BMGY培養(yǎng)基：1.34% YNB，1%酵母提取物，2%蛋白胨，10%PBS（pH 6.0），1%甘油。BMMY培養(yǎng)基：1.34% YNB，1%酵母提取物，2%蛋白胨，10% PBS（pH 6.0）。

1.2 方法

1.2.1 蔗糖合成酶目的基因的優(yōu)化及合成

在 NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得綠豆來源的蔗糖合成酶（Sequence ID：BAA01108.1）。將該基因氨基酸序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司，經(jīng)畢赤酵母密碼子優(yōu)化而獲得的堿基序列，全基因合成后克隆至質(zhì)粒pUC57，得到含有蔗糖合成酶編碼基因的重組質(zhì)粒pUC57-mbSUS。

1.2.2 蔗糖合成酶mbSUS表達(dá)載體的構(gòu)建

在mbSUS基因的兩端引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)，如下所示：mbSUS-F:5'-ACGAGGAATTCA TGGCTACTGACAGATT-3'(EcoRI)；mbSUS-R:5'-GG CGGCCGCCTCAACA GCCAATGGAACA-3'(NotI)。以含有編碼蔗糖合成酶并經(jīng)畢赤酵母密碼子優(yōu)化的基因mbSUS的載體pUC57-mbSUS為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將 PCR產(chǎn)物用試劑盒純化，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對PCR回收產(chǎn)物及質(zhì)粒pPICZA分別進(jìn)行雙酶切，純化回收后用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞，得到表達(dá)載體pPICZA-mbSUS。

1.2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶目的基因的優(yōu)化及合成

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得不含其自身信號肽的甜葉菊UGT76G1氨基酸序列（Sequence ID:AGL95113.1）。將該氨基酸序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司，經(jīng)畢赤酵母密碼子優(yōu)化而獲得的堿基序列，全基因合成后放入質(zhì)粒 pUC57-UGT76G1。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1目的基因的優(yōu)化及合成。

1.2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1表達(dá)載體的構(gòu)建

在UGT76G1基因的兩端引入限制性酶切位點(diǎn)，如下所示：UGT76G1-F:5'-GGATCCATAAGACCGAG ACTACCGTCAGAAGA-3'(BamH I)；UGT76G1-R:5'-GCGGCCGCTATGAAACAAGGGACTCCAAAGATT-3'(NotI)。以含有編碼蔗糖合成酶并經(jīng)畢赤酵母密碼子優(yōu)化的基因UGT76G1的載體pUC57-UGT76G1為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用試劑盒純化，用限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI對PCR回收產(chǎn)物及質(zhì)粒pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，純化回收后用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞，得到表達(dá)載體pPIC9K-UGT76G1。

1.2.5 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pPICZA-mbSUS用限制性內(nèi)切酶MssI線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115/pPIC9K感受態(tài)中，涂布于YPDZ平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d，挑取博來霉素抗性重組轉(zhuǎn)化子，微波裂解菌體獲得基因組。以基因組為模板，進(jìn)行PCR鑒定篩選得到表達(dá)蔗糖合成酶的重組畢赤酵母菌株。重組質(zhì)粒 pPIC9KUGT76G1用限制性內(nèi)切酶SalI線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)中，涂布于MD平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng) 2～4 d，挑取重組轉(zhuǎn)化子，微波裂解菌體獲得基因組。以基因組為模板，進(jìn)行PCR鑒定篩選得到重組工程菌GS115/pPIC9K-UGT76G1。分別取這兩株畢赤酵母重組工程菌接種到10 mL BMGY液體培養(yǎng)基（50 mL的錐形瓶）中，30 ℃恒溫?fù)u床250 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h，至OD600達(dá)到4～6。離心后轉(zhuǎn)至25 mL BMMY培養(yǎng)基（250 mL的錐形瓶，控制起始OD值約為1.0），30 ℃恒溫?fù)u床250 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h取250 μL誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于分析重組菌的生長情況。每次取樣完畢后，補(bǔ)加 1%甲醇，連續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵120 h。

1.2.6 糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶酶活的測定

取200 μL誘導(dǎo)培養(yǎng)液于干凈的2 mL離心管中，控制菌體OD600=60，用蒸餾水洗滌三次之后，棄上清。加入1 mL蒸餾水轉(zhuǎn)移至裝有0.73 g破碎珠的破碎管中，再加入30 μL 1%的蛋白酶抑制劑，置于破碎儀中進(jìn)行破碎，800 r/min破碎1 min后在冰上冰凍1 min，反復(fù)破碎8次之后在4 ℃離心機(jī)中12000 r/min離心10 min，取上清到2 mL干凈的離心管中，放置在冰上保存?zhèn)溆?。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1與反應(yīng)底物混合，200 μL反應(yīng)體系終濃度為pH 7.0的50 mM磷酸鉀緩沖溶液，10 mM MgCl2，10 mM ST，2 mM UDPG，45 ℃搖床200 r/min反應(yīng)20 min。蔗糖合成酶mbSUS與反應(yīng)底物混合，200 μL反應(yīng)體系終濃度為 pH 7.0的50 mM磷酸鉀緩沖溶液，10 mM MgCl2，10 mM 蔗糖，2 mM UDP，45 ℃搖床200 r/min反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后加入200 μL 0.2 mM的磷酸溶液，靜置5 min使酶失活，再加入200 μL的0.2 mM的氫氧化鈉溶液中和pH值。終止反應(yīng)結(jié)束后加入400 μL的蒸餾水稀釋，渦旋振蕩，14000 r/min離心2 min，取上層液體用0.22 μm膜過濾后用于HPLC分析。

色譜檢測條件：pHenomenex Gemini 5u C18柱（250 mM×4.6 mM），流動相為0.20 mol/L的磷酸鹽緩沖液（17.90 g/L磷酸氫二鈉緩沖液和6.80 g/L的磷酸二氫鉀緩沖液）和1.61 g/L的四丁基溴化銨的純水相，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測波長262 nm。使用UDPG標(biāo)準(zhǔn)品（100%）和UDP（99%）通過外標(biāo)法進(jìn)行定量。UDPG和UDP濃度的線性范圍為0.1～2 g/L。

得到UDP和UDPG色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到反應(yīng)生成UDP或者消耗的UDP量，通過一下酶活計(jì)算公式計(jì)算蔗糖合成酶 mbSUS和糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的酶活。

注：酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，1 min催化形成1 mol UDPG所需要的酶量為1個活力單位，其中N：反應(yīng)液后期處理的稀釋倍數(shù)，C：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的生成UDPG或UDP的量，T：反應(yīng)時間。

1.2.7 不同酶量配比生物催化合成RA

用ST為底物分析新構(gòu)建的兩株重組酵母菌中的酶以不同酶活比例混合條件生物催化合成 RA。甲醇誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵120 h后離心收集兩株菌體，用100 mM磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）洗滌兩次。參照1.2.6的破碎方法破碎之后收集上清液，測定酶活。

控制體系中UGT76G1(K)的酶活為10 U，不同體系中mbSUS(S)的酶活為10、20、40、60 U，使體系中兩個酶的酶活配比為 K1+S1、K1+S2、K1+S4、K1+S6按照不同的酶活比例添加到200 μL反應(yīng)體系中，混合體系中各物質(zhì)終濃度分別為pH 7.0的50 mM磷酸鉀緩沖溶液，3 mM MgCl2，10 mmM ST，0.6 mM UDP，50 mM蔗糖。將混合物在45 ℃下反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用蒸餾水稀釋五倍，經(jīng)0.22 μm膜過濾后用于HPLC分析。

控制體系中mbSUS(S)的酶活為10 U，不同體系中UGT76G1(K)的酶活為10、20、40、60 U，使體系中兩個酶的酶活配比為 K1+S1、K2+S1、K4+S1、K6+S1。按照不同的酶活比例添加到200 μL反應(yīng)體系中，混合體系中各物質(zhì)終濃度分別為pH 7.0的50 mM磷酸鉀緩沖溶液、3 mM MgCl2、10 mM ST、0.6 mM UDP、50 mM蔗糖。將混合物在45 ℃下反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用蒸餾水稀釋五倍，經(jīng)0.22 μm膜過濾后用于HPLC分析。

控制不同體系中 mbSUS(S)和 UGT76G1(K)酶活配比，使其中配比分別為K1+S1（K=10 U，S=10 U）、K2+S2（K=20 U，S=20 U）、K4+S4（K=40 U，S=40 U）、K6+S6（K=60 U，S=60 U)。按照不同的酶活比例添加到200 μL反應(yīng)體系中，混合體系中各物質(zhì)終濃度分別為pH 7.0的50 mM磷酸鉀緩沖溶液、3 mM MgCl2、10 mM ST、0.6 mM UDP、50 mM蔗糖。將混合物在45 ℃下反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用蒸餾水稀釋五倍，經(jīng)0.22 μm膜過濾后用于HPLC分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個重組酵母菌株重復(fù)發(fā)酵三次，每次酶活測定以及反應(yīng)合成RA設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)值為平行樣品的平均值，用誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pUC57-mbSUS為模板，PCR擴(kuò)增得到約2400 bp的mbSUS基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切后，連接載體片段構(gòu)建pPICZA- mbSUS重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切并用凝膠電泳鑒定。如圖2a所示，雙酶切得到兩條帶分別為3279 bp和2426 bp，與預(yù)期的目的片段大小一致，經(jīng)DNA測序后無堿基突變，結(jié)果正確，重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。重組質(zhì)粒pPICZA- mbSUS經(jīng)限制性內(nèi)切酶MssI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115/pPIC9K感受態(tài)中。YPDZ平板初篩得到的重組轉(zhuǎn)化子，微波裂解粗提基因組經(jīng)PCR凝膠電泳鑒定。如圖2b所示，在2700 bp左右擴(kuò)增出一條特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致，表明pPICZA-mbSUS已成功整合到GS115基因組上。

圖2 重組質(zhì)粒pPICZA-mbSUS的雙酶切鑒定及轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.2 Dual-enzyme identification of transformant pPICZA-mbSUS and PCR identification of transformants

以質(zhì)粒pUC57-UGT76G1為模板，PCR擴(kuò)增得到約1377 bp的UGT76G1基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI雙酶切后，連接載體片段構(gòu)建pPIC9K-UGT76G1重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和NotI雙酶切并用凝膠電泳鑒定。如圖3a所示，雙酶切得到兩條帶分別約為8979 bp和1376 bp，與預(yù)期的目的片段大小一致，經(jīng)DNA測序后無堿基突變，結(jié)果正確，重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。重組質(zhì)粒pPIC9K-UGT76G1經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)中。MD平板初篩得到的重組轉(zhuǎn)化子，微波裂解粗提基因組經(jīng)PCR凝膠電泳鑒定。如圖3b所示，在1376 bp左右擴(kuò)增出一條特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致，表明 UGT76G1已成功整合到GS115基因組上。

圖3 重組質(zhì)粒pPIC9K-UGT76G1的雙酶切鑒定及轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.3 Dual-enzyme identification of transformant pPIC9K-UGT76G1 and PCR identification of transformants

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶畢赤酵母高效表達(dá)體系的構(gòu)建

圖4 重組畢赤酵母菌株生長曲線Fig.4 Recombinant Pichia pastoris growth curve

重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)120 h后，生長情況正常，如圖4所示。從圖上看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩株重組菌株的菌體數(shù)量都逐漸提高，甲醇誘導(dǎo)到120 h時生長趨于穩(wěn)定。兩株重組菌株生長情況相似，與對照菌株的生長情況相比較，兩株重組畢赤酵母菌株的生長情況均受到了一定影響。

收集經(jīng)甲醇誘導(dǎo)120 h后的菌液，蒸餾水洗滌3遍后進(jìn)行破碎處理，提取上清液按照1.2.6的方法測定酶活。根據(jù)酶活公式計(jì)算重組菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mbSUS的酶活，所得酶活如圖5所示，在反應(yīng)條件下，糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的酶活約為141.22 U/g，蔗糖合成酶mbSUS的酶活約為121.39 U/g。

圖5 重組畢赤酵母菌株UGT76G1和蔗糖合成酶產(chǎn)酶分析Fig.5 Enzyme activity of recombinant Pichia pastoris strains

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶級聯(lián)反應(yīng)催化體系構(gòu)建及萊鮑迪苷A合成

在生物催化反應(yīng)中，添加 U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:1的條件下反應(yīng)3 h，RA產(chǎn)量為4.96 mM，固定體系中UGT76G1的酶活為10 U，不同體系中mbSUS酶活分別為10、20、40、60 U，使體系中兩個酶的酶活配比為K1+S1，K1+S2，K1+S4，K1+S6，如圖6 a所示，隨著蔗糖合成酶mbSUS酶活的增加，RA產(chǎn)量增加。在添加U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:6的條件下反應(yīng)3 h，RA產(chǎn)量為5.81 mM，與U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:1酶活比例條件下RA產(chǎn)量相比提高了17.14%。在提高mbSUS的酶活情況下，蔗糖和UDP作為底物充足的條件下，積累了大量的UDPG，而糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的量是固定的，繼續(xù)增加mbSUS，UGT的轉(zhuǎn)化速度可能跟不上 mbSUS的轉(zhuǎn)化速度，因此不能大量催化合成RA。

固定體系中mbSUS的酶活為10 U，不同體系中UGT76G1酶活分別為10、20、40、60 U，使體系中兩個酶的酶活配比為K1+S1，K2+S1，K4+S1，K6+S1，如圖6b所示，隨著糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1酶活的增加，RA產(chǎn)量有明顯的增長。當(dāng)UGT76G1的酶活增加到60 U時，與添加40 U的糖基轉(zhuǎn)移酶相比，RA產(chǎn)量僅提高7.04%。說明此時，體系內(nèi)UGT與mbSUS的循環(huán)速率可能達(dá)到最佳，級聯(lián)反應(yīng)獲得最優(yōu)平衡。添加60 U糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT76G1和 10 U蔗糖合成酶mbSUS反應(yīng) 3 h，RA產(chǎn)量為 8.20 mM，與U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:1酶活比例催化相比，RA產(chǎn)量提高了65.32%，在此生物催化級聯(lián)反應(yīng)過程中，糖基轉(zhuǎn)移酶的量增加到一定程度，由于缺少蔗糖合成酶催化蔗糖生成果糖提供UDPG作為底物催化甜菊糖苷生物合成大量的萊鮑迪苷A。

在催化反應(yīng)過程之中，同時增加 UGT76G1和mbSUS的酶量，研究其對合成RA的影響。如圖6c所示，糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT76G1和蔗糖合成酶 mbSUS的酶量同時增加，RA的產(chǎn)量有少量增加，糖基轉(zhuǎn)移酶mbSUS能可逆催化蔗糖和UDP生成UDPG，提高蔗糖合成酶的酶活，可以大量積累UDPG。在催化反應(yīng)體系中，UDPG作為底物可以通過糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1催化甜菊糖苷生成萊鮑迪苷 A，隨著糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mbSUS酶活的同時增加，RA產(chǎn)量提高，在添加U(UGT76G1):U(mbSUS)=6:6的條件下反應(yīng) 3 h，RA 產(chǎn)量為 6.38±1.03 mM，與U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:1酶活比例反應(yīng)相比，RA產(chǎn)量提高了28.63%。

在對上述不同反應(yīng)條件進(jìn)行比較后，得到糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mbSUS這兩個酶在不同酶量比例反應(yīng)生成 RA的最適酶活比例為U(UGT76G1):U(mbSUS)=6:1，反應(yīng)3h RA產(chǎn)量為8.20±0.11 mM，RA的產(chǎn)率達(dá)到82.91%。如圖6d所示，最適的反應(yīng)條件為單獨(dú)提高糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT676G1的酶活到60 U，添加蔗糖合成酶mbSUS的酶活為10 U，在此酶活比例條件下既避免蔗糖合成酶 mbSUS過量，UGT的轉(zhuǎn)化速度跟不上mbSUS的轉(zhuǎn)化速度，同時也提供適量的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1進(jìn)行催化糖基轉(zhuǎn)移化反應(yīng)，UGT作為級聯(lián)反應(yīng)中的限速酶，提高其比例，能有效推動循環(huán)，提高RA產(chǎn)量。

圖6 UGT76G1和蔗糖合成酶不同比例組合催化合成萊鮑迪苷A效率比較Fig.6 Comparison of the efficiency of catalytic synthesis of rebaudioside A with different ratios of UGT76G1 and sucrose synthase

3 結(jié)論

3.1 萊鮑迪苷A作為甜菊糖苷中甜味高、口感好的成分，獲取高純度萊鮑迪苷A的產(chǎn)品是甜菊糖產(chǎn)品的一個重要發(fā)展方向。本研究利用畢赤酵母重組高效表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mbSUS，建立了雙酶級聯(lián)生物催化反應(yīng)體系，優(yōu)化了添加兩個酶的最佳酶量配比為U(UGT76G1):U(mbSUS)=6:1，反應(yīng)3 h RA產(chǎn)量為8.20±0.11 mM，RA的產(chǎn)率達(dá)到82.91%，較添加U(UGT76G1):U(mbSUS)=1:1酶活比例條件催化，RA產(chǎn)量提高了1.65倍。與此前唐畢赤酵母重組菌株相比，RA產(chǎn)量是其全細(xì)胞催化反應(yīng)所得RA產(chǎn)率的1.10倍，生物催化反應(yīng)時間縮短了5倍，與在大腸桿菌中進(jìn)行糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT76G1和擬南芥來源的蔗糖合成酶AtSUS純酶催化RA相比，本研究催化所得RA的產(chǎn)率是其催化反應(yīng)所得RA產(chǎn)率的1.22倍，且反應(yīng)時間縮短了10倍。

3.2 本研究通過添加糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1與蔗糖合成酶mbSUS，可以在生物催化過程中實(shí)現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)過程中UDPG的循環(huán)，在提高了RA產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，極大的減少了催化反應(yīng)時間，提高了RA的生產(chǎn)效率。此外本研究發(fā)現(xiàn)在此級聯(lián)反應(yīng)中糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1作為限速酶在一定程度上影響了 RA的合成，后續(xù)研究可以通過提高基因劑量實(shí)現(xiàn)外源蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)的高效表達(dá)。