新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

梅艷秋，羅 燕，鐘 斌，林小鳳，鄺 瑩，易小慶，曾衛(wèi)佳，楊 民，黃啟同，6，8，9

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2020級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院科研中心；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；4. 贛南醫(yī)學(xué)院醫(yī)用信息工程學(xué)院；5. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；6. 江西省油茶醫(yī)藥保健及功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工程研究中心；7. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；8. 江西省醫(yī)用組織工程材料與生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；9. 心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000）

目前，席卷全球的新型冠狀肺炎（COVID-19）主要由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的，SARS-CoV-2是β冠狀病毒屬的新成員，其與嚴(yán)重急性呼吸綜合征—冠狀病毒（SARS-CoV）等密切相關(guān)，是第七個(gè)可感染人類(lèi)的冠狀病毒［1-3］。圖1為美國(guó)首例新冠肺炎患者體內(nèi)分離出SARS-CoV-2 的透射電鏡（TEM）圖，TEM 顯示其結(jié)構(gòu)為直徑在80～220 nm的微球形，具有囊膜和12～24 nm 的棒狀刺突，具有典型的“冠狀”病毒的形態(tài)特征［4］。目前COVID-19 的主要感染源是COVID-19感染者、潛伏期感染者和無(wú)癥狀感染者，其主要的傳播途徑包括：飛沫傳播、接觸傳播、氣溶膠傳播以及其他可能的傳播途徑，如糞口傳播等［5-7］。截至2020年12月1日，全球累計(jì)確診63 751 110人，累計(jì)死亡人數(shù)達(dá)到1 477 200。由于COVID-19 具有非常強(qiáng)的傳染性和致死性，目前全球各個(gè)國(guó)家都在尋求有效的預(yù)防和治療方法，而預(yù)防的關(guān)鍵在于對(duì)患者的早診斷、早隔離、早治療。

圖1 SARS-CoV-2的TEM圖［4］

開(kāi)發(fā)快速、靈敏、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地檢測(cè)SARS-CoV-2方法對(duì)于疫情防控至關(guān)重要。2003年的SARS-CoV、2012 年的中東呼吸綜合征（MERS-CoV）以及現(xiàn)在流行的SARS-CoV-2 均屬人類(lèi)冠狀病毒（HCoV），只是他們所處的菌株型不同，但是菌株結(jié)構(gòu)大同小異，所以可借鑒之前對(duì)其他HCoV 的檢測(cè)方法對(duì)SARS-CoV-2 進(jìn)行檢測(cè)。目前我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)了至少11 種基于核酸的方法和8種抗體檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)SARS-CoV-2［8］。隨著對(duì)COVID-19研究的不斷深入，新的生物化學(xué)檢測(cè)手段也被不斷地開(kāi)發(fā)出來(lái)，目前對(duì)SARS-CoV-2 的測(cè)定最有效的手段是通過(guò)核酸或者抗體檢測(cè)（圖2）［9］。本文對(duì)目前已有的SARS-CoV-2 的生物化學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)。

1 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)

圖2 用于SARS-CoV-2的兩種主要測(cè)試方法：核酸和抗體檢測(cè)［9］

核酸檢測(cè)是作為診斷COVID-19 的主要方法，目前常用的核酸檢測(cè)法包括宏基因組學(xué)測(cè)序［10-12］、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）［13］、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）［14-16］和核酸生物傳感器［17］等，這些技術(shù)的發(fā)展為COVID-19的臨床診斷和預(yù)防提供了重要的技術(shù)支持。

1.1 宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)用于檢測(cè)SARS-CoV-2宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)無(wú)須對(duì)病毒微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒微生物的鑒定與臨床診斷，基于宏基因組學(xué)測(cè)序得到SARS-CoV-2 病毒全基因組序列，為SARS-CoV-2列為β冠狀病毒屬的新成員提供了依據(jù)。因此，在疫情暴發(fā)早期階段，SARS-CoV-2病毒的宏基因組測(cè)序作為確定COVID-19 患者的主要手段。張永振教授團(tuán)隊(duì)率先完成第一個(gè)SARS-CoV-2 基因組的測(cè)序工作，并系統(tǒng)比對(duì)了SARS-CoV-2基因與其他類(lèi)冠狀病毒基因的差異性，其與SARS 病毒基因組的相似度達(dá)到了89.1%，為SARS-CoV-2 的演化來(lái)源提供了依據(jù)［10］。隨后，LU等［11］對(duì)獲得了8個(gè)完整的SARS-CoV-2 基因組序列，并與其他冠狀病毒的基因組序列進(jìn)行了詳細(xì)比對(duì)，系統(tǒng)分析了其與其他病毒基因的相似片段與差異性片段。目前，國(guó)家衛(wèi)健委已將基因組測(cè)序中得到與已知的SARS-CoV-2 高度同源的結(jié)果，作為COVID-19 臨床確診的依據(jù)之一［12］。雖然宏基因組學(xué)測(cè)序成本較高，但是宏基因組學(xué)測(cè)序不僅為SARS-CoV-2的來(lái)源、發(fā)病機(jī)制的分析提供了技術(shù)支撐，還為新型SARS-CoV-2 檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 RT-PCR 用于檢測(cè)SARS-CoV-2RT-PCR 是使用呼吸道樣本（鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽洗液、鼻腔抽吸物、痰液、灌洗液以及氣管吸出物等）診斷COVID-19 的 最 主 要 方 法［14-16］。 RT-PCR 將SARS-CoV-2 RNA 反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）鏈，然后擴(kuò)增cDNA 的特定區(qū)域。設(shè)計(jì)過(guò)程通常包括兩個(gè)主要步驟，一為序列比對(duì)和引物設(shè)計(jì)；二為分析條件的優(yōu)化和測(cè)試。CORMAN 等［14］在與SARS 相關(guān)的病毒基因組分析中設(shè)計(jì)了雙“引物—探針”體系。第一個(gè)引物組可以普遍檢測(cè)許多冠狀病毒，而第二個(gè)引物組只能檢測(cè)SARS-CoV-2。之后優(yōu)化測(cè)定條件（試劑條件、孵育時(shí)間和溫度），隨后進(jìn)行PCR 測(cè)試，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 RNA 測(cè)定。RT-PCR 可分為一步法或兩步法進(jìn)行測(cè)定。在一步測(cè)定中，反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增被整合為一個(gè)反應(yīng)，這種測(cè)定方法為高通量分析提供了快速且可重復(fù)的結(jié)果。缺點(diǎn)在于逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟同時(shí)進(jìn)行，優(yōu)化過(guò)程很難實(shí)現(xiàn)，從而導(dǎo)致靶標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量降低。在兩步測(cè)定中，反應(yīng)在單獨(dú)的試管中依次進(jìn)行，這種形式的分析法比單步分析法更敏感，但需要更多的時(shí)間去進(jìn)行其他參數(shù)的優(yōu)化。

RT-PCR 可用來(lái)診斷COVID-19，但是實(shí)際測(cè)試的敏感性和特異性相差很大，缺乏一致性，AI 等［15］研究表明其準(zhǔn)確率僅為66%～80%，與此同時(shí)，AREVALO-RODRIGUEZ 等［16］也得出其檢測(cè)結(jié)果假陰性率在2%～29%之間，其準(zhǔn)確性低大致是因?yàn)闄z測(cè)時(shí)病毒載量低于最低檢測(cè)值、專(zhuān)業(yè)人士操作不佳、所用核酸提取方法不適當(dāng)、靶向DNA 序列未檢測(cè)、探針和引物設(shè)計(jì)不良等諸多因素導(dǎo)致。

1.3 核酸生物傳感器用于檢測(cè)SARS-CoV-2生物傳感器在病毒檢測(cè)等領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用，其是一種能產(chǎn)生與被分析物濃度成比例的可量化信號(hào)的分析裝置。它們由換能器和生物活性元件或材料組成，如核酸、酶和抗體等，它們可通過(guò)特異性的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)與分析［17-19］。目前，生物傳感器主要包括熒光、光散射、表面增強(qiáng)拉曼散射、電化學(xué)和表面等離子體共振等技術(shù)［17-21］。由于生物傳感器廉價(jià)、簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，可為非專(zhuān)業(yè)人員和公眾提供切實(shí)可行的分析技術(shù)，因此，其受到了研究學(xué)者的廣泛青睞。

JIAO 等［22］制備了基于DNA 納米支架雜交鏈反應(yīng)的新型DNA 熒光傳感器，并成功地應(yīng)用于SARS-CoV-2 RNA 的測(cè)定。首先DNA 納米支架由長(zhǎng)DNA 單鏈（RCA）和一些H1 探針（由立足點(diǎn)序列F1、發(fā)夾結(jié)構(gòu)S'C1S 和尾部T1 組成）通過(guò)雜交組成。然后用5-羧基熒光素（FAM）染料和其猝滅劑（BHQ1）分子標(biāo)記以形成自淬滅探針，發(fā)夾打開(kāi)時(shí)熒光將恢復(fù)。當(dāng)目標(biāo)SARS-CoV-2 RNA 存在時(shí)，它會(huì)觸發(fā)沿DNA 納米支架的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在不添加目標(biāo)的情況下，其具有弱的熒光信號(hào)，當(dāng)存在SARS-CoV-2 RNA的情況下，游離的H1 和H2 能夠相互雜交以觸發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR），從而導(dǎo)致熒光的恢復(fù)。由此構(gòu)建出新型的熒光DNA 生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 RNA 的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限（LOD）達(dá)到了0.96 pM（圖3）。該方法具有高信號(hào)增益、反應(yīng)時(shí)間短、特異性高、室溫響應(yīng)、方便檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 基于DNA納米支架雜交鏈反應(yīng)的新型DNA熒光傳感器用于測(cè)定SARS-CoV-2 RNA［22］

QIU 等［23］構(gòu)建了等離子體光熱效應(yīng)（PPT）和局部表面等離子體共振（LSPR）傳感轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合的雙功能等離子體生物傳感器。該傳感器主要是基于二維金納米粒子（AuNIs），并通過(guò)DNA 互補(bǔ)雜交技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 中的選定序列進(jìn)行敏感檢測(cè)，其LOD 達(dá)到0.22 pM，并允許在多基因混合物中精確檢測(cè)特定靶點(diǎn)。該項(xiàng)研究為PPT-LSPR 生物傳感器在SARS-CoV-2檢測(cè)方面提供了新的思路。

ZHU 等［24］開(kāi)發(fā)了一種多重逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（mRT-LAMP）與基于納米顆粒的側(cè)流式生物傳感器（mRT-LAMP-LFB）相結(jié)合，用于診斷COVID-19，能在1 小時(shí)內(nèi)快速檢測(cè)出病毒中的ORF1ab 和核蛋白基因（N）。BROUGHTON 等［25］針對(duì)SARS-CoV-2開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12的LFB 生物傳感器，比mRT-LAMP-LFB 傳感器的檢驗(yàn)時(shí)間縮短了半小時(shí)。

ZHAO 等［26］使用杯芳烴官能化的氧化石墨烯與靶向SARS-CoV-2 RNA 的合成了一個(gè)超三明治型電化學(xué)傳感器（圖4），該傳感器用于臨床標(biāo)本SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)時(shí)的LOD低至200 copies·mL-1。基于此傳感器也開(kāi)發(fā)了一種即插即用的方法，甚至可用在智能手機(jī)上，實(shí)現(xiàn)無(wú)須RNA 擴(kuò)增即可靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)各種臨床中的SARS-CoV-2 樣品，從而提供了一種簡(jiǎn)單、低成本檢測(cè)方法。TRIPATHY等［27］利用無(wú)標(biāo)簽電化學(xué)檢測(cè)DNA 雜交合成了一種微型電化學(xué)生物傳感器，可作為一種潛在的方法用于COVID-19 的診斷。這個(gè)方法簡(jiǎn)單且便攜，可以擺脫笨重的檢測(cè)設(shè)備，能在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)操作，基于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)出快速診斷和即時(shí)診斷檢測(cè)設(shè)備提供了參考。

CHAIBUN 等［28］開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合等溫滾圈放大（RCA）的電化學(xué)生物傳感器，用于對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行高靈敏度和特異性的檢測(cè)。利用RCA 的高擴(kuò)增能力和高靈敏性的電化學(xué)檢測(cè)方法，使我們能在合成的線性靶標(biāo)和/或臨床標(biāo)本中檢測(cè)到病毒的N和S基因，整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)不到2小時(shí)，該方法對(duì)臨床樣本的檢驗(yàn)性能可與RT-PCR 相比較。該傳感器可用于COVID-19的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)診斷。

總之，隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的檢測(cè)技術(shù)被開(kāi)發(fā)用于SARS-CoV-2 的測(cè)定，表1顯示了截至目前為止部分SARS-CoV-2 核酸測(cè)定的方法，通過(guò)不同方法的對(duì)比，希望后續(xù)研究學(xué)者能夠開(kāi)發(fā)出更加靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)以及準(zhǔn)確的COVID-19核酸測(cè)定方法。

圖4 三明治型電化學(xué)傳感器檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA 的示意圖［26］

表1 SARS-CoV-2核酸測(cè)定的方法對(duì)比

2 SARS-CoV-2蛋白檢測(cè)

雖然SARS-CoV-2 核酸測(cè)定已得到了廣泛的研究，但從SARS-CoV-2 的蛋白結(jié)構(gòu)圖（圖5）可以看出，將整個(gè)病毒顆?；蚱湎鄳?yīng)的表面抗原表位作為傳感器檢測(cè)標(biāo)志物也可有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2的測(cè)定［39］。許多研究表明，IgM 抗體在癥狀發(fā)作后約5～10天開(kāi)始可檢測(cè)到并迅速升高，然后緊接著是IgG 抗體反應(yīng)，這些血清轉(zhuǎn)化通常發(fā)生在總抗體癥狀發(fā)作后的前3 周內(nèi)，平均時(shí)間為9～11 天（IgM 為10～12 天，IgG 為12～14 天）［40］，這些病毒感染后的免疫反應(yīng)為SARS-CoV-2 的蛋白檢測(cè)提供了可能，所以可利用病毒自帶的蛋白質(zhì)（例如S蛋白）或者患者樣品中的抗體（例如IgM和IgG）進(jìn)行檢測(cè)。

圖5 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)示意圖［39］

ZHANG 等［41］針對(duì)SARS-CoV-2 核衣殼蛋白（N蛋白）制備了DNA 適體。N 蛋白是最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白之一，它可作為準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)SARS-CoV-2 的診斷標(biāo)記。他們通過(guò)使用四個(gè)DNA 序列（親和力低于5 nM）分別生成了四對(duì)適體，而且這四對(duì)適體由于三明治型相互作用，可以先后與N 蛋白結(jié)合，在ELISA 和膠體金免疫色譜條中使用這些夾心的適體，能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏地（1 ng·mL-1）檢測(cè)N蛋白。

MAVRIKOU 等［42］制備了一種基于便攜式無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞的生物測(cè)定方法，可檢測(cè)SARS-CoV-2的突觸蛋白抗原S1。該生物傳感器以超快速的方式（3 min）提供結(jié)果，檢測(cè)極限為1 fg·mL-1，此外，沒(méi)有觀察到與N 蛋白的交叉反應(yīng)性。無(wú)須事先對(duì)樣品進(jìn)行處理，就能大規(guī)模篩選SARS-CoV-2 表面抗原，為及時(shí)監(jiān)測(cè)冠狀病毒提供了依據(jù)。

FABIANI 等［43］建立了一種快速、智能檢測(cè)唾液中SARS-CoV-2 的電化學(xué)免疫分析方法（圖6）。以磁珠為免疫鏈載體，以堿性磷酸酶為免疫標(biāo)記物的二級(jí)抗體為免疫標(biāo)記物，建立了檢測(cè)棘突蛋白（S 蛋白）或核衣殼蛋白（N蛋白）的電化學(xué)方法。用炭黑納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)酶副產(chǎn)物萘酚。該方法對(duì)S 蛋白和N 蛋白的檢出限分別為19 ng·mL-1和8 ng·mL-1，將該方法用于唾液樣本中SARS-CoV-2的直接檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)PCR 的檢測(cè)結(jié)果一致。該方法具有檢測(cè)限低，分析快速（30 min），儀器小型化，便攜性好，使用方便，無(wú)創(chuàng)采樣，且可用于檢測(cè)未經(jīng)處理的唾液中的SARS-CoV-2，該分析工具具有很高的市場(chǎng)準(zhǔn)入潛力。

圖6 磁珠為免疫鏈載體，以堿性磷酸酶為免疫標(biāo)記物的二級(jí)抗體為免疫標(biāo)記物，建立了檢測(cè)S 蛋白或N 殼蛋白的電化學(xué)方法［43］

SEO 等［44］合成了一種基于場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）的生物傳感設(shè)備，能檢測(cè)臨床樣品中的SARS-CoV-2。它是通過(guò)S蛋白的特異性抗體覆蓋在FET 的石墨烯片制成的。該傳感器具有良好的靈敏度：培養(yǎng)基中的SARS-CoV-2（LOD：1.6×101pfu·mL-1）和臨床樣品（LOD：2.42×102pfu·mL-1）都被成功檢測(cè)出，說(shuō)明該FET生物傳感器具有非常優(yōu)異的潛在使用性。

目前，蛋白的檢測(cè)雖然已取得了可觀的進(jìn)展（表2），我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局目前也已經(jīng)批準(zhǔn)了8 種用于SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)的試劑盒，但目前仍有假陰性或者假陽(yáng)性的情況出現(xiàn)，因此，結(jié)合核酸檢測(cè)和CT檢測(cè)，將彌補(bǔ)蛋白檢測(cè)的這一缺點(diǎn)。

表2 SARS-CoV-2蛋白測(cè)定的方法對(duì)比

3 結(jié)論與展望

迅速、靈敏、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2 檢測(cè)對(duì)疫情的控制與監(jiān)測(cè)非常重要。目前，無(wú)論是核酸檢測(cè)還是蛋白檢測(cè)仍存在不足，因此，通過(guò)兩種目標(biāo)物的測(cè)定，結(jié)合CT 檢測(cè)，將有效地預(yù)防假陽(yáng)性或者假陰性的產(chǎn)生。本次疫情的嚴(yán)重性也提醒我們有必要為未來(lái)任何病毒或其他致病性微生物暴發(fā)做好準(zhǔn)備。其中，快速檢測(cè)方法的不斷開(kāi)發(fā)是預(yù)防和管理未來(lái)可能發(fā)生的流行病的關(guān)鍵。因此，開(kāi)發(fā)出廉價(jià)、快速、高通量和便攜式篩查技術(shù)顯得尤為重要?；诠δ懿牧?、納米技術(shù)的新型傳感器具有靈敏度高和成本低的優(yōu)勢(shì)，此類(lèi)傳感器在未來(lái)的應(yīng)用前景將會(huì)得到不斷重視。同時(shí)，新的智能傳感方法將生物傳感器的超高靈敏度與人工智能和物聯(lián)網(wǎng)相結(jié)合，有助于更好地發(fā)現(xiàn)和預(yù)防潛在的傳染性疾病。總之，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷完善和疫苗的即將問(wèn)世，COVID-19在不久的將來(lái)必將得到有效控制。