高效液相色譜法測定化妝品中防曬劑奧克立林含量的不確定度評定

邸 錚， 賈伯陽， 周 荔， 王 穎， 左 雪, 張 蓉， 鄔國慶

(北京市藥品檢驗所，北京 102206)

1 引 言

防曬類化妝品屬特殊用途化妝品，其中含有的防曬劑成分是利用光的吸收、反射或散射作用加入的物質(zhì)，用于保護皮膚免受紫外線傷害[1]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)(以下簡稱“規(guī)范”)中規(guī)定了27種準用防曬劑，并提供了15種防曬劑測定的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)。其中，奧克立林(化學(xué)名稱：2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸異辛酯)屬于UVB(320～290 nm)紫外吸收劑，多用于高SPF(防曬指數(shù))的產(chǎn)品中[2,3]，是經(jīng)美國FDA批準的I類防曬劑，也因其具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，且吸收率高、無毒、無致畸作用[4]，成為目前高端化妝品使用頻次較高的一種防曬劑。

對于化妝品中防曬劑的監(jiān)測，一直是化妝品監(jiān)督抽驗與安全風險監(jiān)測工作的重點內(nèi)容。為確保實驗室維持較高的防曬劑檢測水平，及時發(fā)現(xiàn)和糾正在檢驗過程中存在的問題，嚴格控制和提高實驗室的質(zhì)量管理水平，本實驗室參加了防曬劑中奧克立林的能力驗證工作，并通過建立數(shù)學(xué)模型，分析了對結(jié)果產(chǎn)生影響的不確定度來源。測量不確定度是對測量結(jié)果可能誤差的度量，也是定量說明測量結(jié)果質(zhì)量好壞的一個參數(shù)[5]。目前，對于化妝品中防曬劑測定不確定度的評定鮮有報道。

本文依據(jù)測量不確定度評定準則[6～9]，采用規(guī)范方法，對能力驗證樣品中奧克立林含量進行測定，建立了高效液相色譜法測定化妝品中防曬劑的不確定度評定方法，通過分析不確定度的來源，尋找影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，為提高防曬劑的檢測水平提供了參考依據(jù)。

2 儀器與實驗材料

2.1 儀 器

e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XS 205D電子分析天平(瑞士Mettler公司)。

2.2 實驗材料

10，25，50 mL容量瓶，1，2 mL單標線吸量管，5 mL分度吸量管，依據(jù)JJG 196-2006常用玻璃量器[10]檢定規(guī)程檢定為A類；能力驗證樣品(性狀：白色乳液，來源：中國食品藥品檢定研究院，樣品編號：TC 137-134)；奧克立林對照品(來源：德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，純度：98.0%)；甲醇、四氫呋喃為色譜純(來源：德國Merck公司)；高氯酸為分析純(來源：天津政成化學(xué)制品有限公司)，水為超純水。

3 試驗方法

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6 mm×25 cm；5 μm)；流動相為甲醇：四氫呋喃：高氯酸水溶液(0.2 mL高氯酸+300 mL水)梯度洗脫，見表1；檢測波長為311 nm，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。在此條件下奧克立林與甲氧基肉桂酸乙基己酯的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)為66 873。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC (%)

3.2 對照品及標準曲線溶液制備

精密稱取奧克立林對照品12 mg置于10 mL容量瓶中，加四氫呋喃溶解并稀釋至刻度，得對照品儲備液。再精密量取5 mL置于50 mL量瓶中，加混合溶液(甲醇+四氫呋喃+水+高氯酸=250+450+300+0.2,單位mL)稀釋至刻度，得對照品溶液Std5，再精密量Std5溶液0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分別置于 10 mL容量瓶中，加混合溶液稀釋至刻度，得對照品標準曲線溶液Std1～Std4。

3.3 供試品溶液制備

取供試品攪拌均勻，精密稱取0.25 g置25 mL容量瓶中，混合溶液溶解，渦旋混勻，超聲振提30 min后混合溶液定容至刻度，混勻，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加混合溶液稀釋至刻度。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

3.4 測定方法

分別精密吸取對照品標準曲線溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，利用標準曲線法計算含量。

3.5 數(shù)學(xué)模型

供試品中奧克立林的含量測定公式表示為：

(1)

式中：W為供試品中被測組分的含量(以酸計)，%；C為供試品中被測組分的濃度，μg/mL；V為供試品溶液定容體積，mL；M為供試品稱樣量，g；0.689 6為奧克立林由酯折算為酸的折算系數(shù)。

4 結(jié)果與分析

4.1 不確定度的來源

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，奧克立林含量的不確定度來源主要有以下幾方面：(1) 對照品的純度(PR),稱樣量(MR),對照品標準曲線的制備(VR)和擬合(Ci)；(2) 供試品稱樣量(MS),溶液制備(VS),供試品的重復(fù)測量(SS);(3) 對照品的積分峰面積重復(fù)性(R)。高效液相色譜法的不確定度通過對照品重復(fù)性測量予以體現(xiàn)。

4.2 不確定度分量的評定

4.2.1 標準溶液及工作曲線對不確定度的貢獻

(1) 對照品純度的相對標準不確定度urel(PR)

證書上標注奧克立林對照品的純度為98.0%，不確定度為0.5%，則由對照品引入的不確定度

(2) 對照品稱量的相對標準不確定度urel(MR)

稱量值m=12.03 mg，其稱量不確定度來源有3項：①重復(fù)性；②數(shù)字分辨率，即可讀性；③天平校準產(chǎn)生的不確定度的分量。

因天平稱量兩次(一次稱樣，一次稱皮重)，故

則對照品稱量的相對標準不確定度為：

urel(MR)=u(MR)/m=
0.129/12.03=0.010 7

(3) 對照品溶液配制的相對標準不確定度urel(CV)

配制標準溶液時所用吸量管、容量瓶帶來的不確定度，分為：①u(CV(V))，吸量管、容量瓶校準不確定度；②u(CV(T))，溫差導(dǎo)致溶液膨脹的不確定度。需用到的玻璃器具見表2。

表2 玻璃儀器列表[11～13]Tab.2 List of glass instruments mL

表3 吸量管和容量瓶引入的不確定度Tab.3 Uncertainty introduced by measuring pipet and measuring flask

根據(jù)表3各分量相對標準不確定度結(jié)果，求得 合成相對標準不確定度：

(4) 標準曲線擬合引入的不確定度urel(Ci)

配制標準曲線溶液，每一濃度測定2次，以濃度Xi為橫坐標，峰面積Yi為縱坐標，擬合標準曲線得線性方程(Yi=a+bXi)，液相色譜校正表擬合的標準曲線為：Y=7531+19878X，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。對同一樣品進行了6次測量，濃度平均值C0=12.393 μg/mL。

按式(2)計算Yi殘差的標準偏差，按式(3)計算奧克立林濃度的標準不確定度，相關(guān)量值的計算結(jié)果見表4。

表4 標準曲線擬合引入的不確定度Tab.4 Uncertainty introduced by the standard curve fitting

(2)

(3)

(4)

式中：Yij為由儀器測得標準曲線各濃度點對應(yīng)的峰面積測定值；Yi為由線性方程得標準曲線各濃度點對應(yīng)的峰面積計算值；C0為由線性方程計算得到的樣品濃度平均值, μg·mL-1；P為樣品測定次數(shù)(P=6)；n為標準曲線溶液的濃度個數(shù)(n=5)；m為標準曲線溶液各點濃度的重復(fù)測量次數(shù)(m=2)；Xij為標準曲線系列溶液的濃度測定值,μg/mL。

則標準曲線擬合的相對標準不確定度為：

urel(Ci)=0.084 2/12.393=0.006 79

(5) 標準溶液及工作曲線引入的相對標準不確定度由urel(PR)、urel(MR)、urel(CV)、urel(Ci)合成，即：

=0.013 9。

4.2.2 供試品制備對不確定度的貢獻

(1)供試品稱量引入的不確定度urel(MS)

單次稱量的標準不確定度：

天平稱量兩次

供試品稱量的相對標準不確定度為：

urel(MS)=u(MS)/M=0.912/253.6=0.003 60

(2) 供試品定容體積引入的不確定度urel(VS)

供試品用提取溶劑超聲并定容至25 mL容量瓶中，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中。其不確定度來源有3項：1 mL單標線刻度管、10 mL、25 mL容量瓶容積帶來的校準不確度u1(V)和溫差帶來的不確定度u2(V)。參考第4.2.1(3)節(jié)中容量瓶的不確定度評定方式及玻璃器具列表2，計算結(jié)果見表5。

表5 定容體積引入的不確定度計算Tab.5 Uncertainty introduced by constant volume

由供試品定容體積引入的相對標準不確定度：

(3) 供試品重復(fù)性測定引入的不確定度urel(SS)

urel(SS)=0.003 09/0.843=0.003 67。

(4) 供試品制備引入的不確定度urel(M)

供試品制備引入的相對標準不確定度由urel(MS)、urel(VS)、urel(SS)合成，即：

= 0.006 02。

4.2.3 測量重復(fù)性對不確定度的貢獻Urel(R)

取濃度為11.79 μg/mL的標準曲線溶液重復(fù)測量5次(n=5)，測定結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性試驗測定結(jié)果Tab.6 Determination result of repeatability test

利用貝塞爾公式計算求得實驗標準差后，用平均值標準差表示重復(fù)性標準不確定度。

urel(R)=u(R)/A

=871/244 638=0.003 56。

4.3 合成不確定度urel(W)

各分量相對標準不確定度見表7所示。

合成不確定度為：

=0.015 6

實驗中測得奧克立林含量平均值H為0.843%，則

u(W)=urel(W)×H

=0.015 6×0.843%=0.013 2%

4.4 擴展不確定度U95及測定結(jié)果報告

取擴展因子k=2(置信度為95%)，則奧克立林的擴展不確定度為

U95=k×u(W)
=2×0.013 2%=0.026%

當奧克立林測定結(jié)果為0.843%時，則含量的結(jié)果表示為

(0.843±0.026)%；k=2。

5 結(jié) 論

從各不確定度分量分析可知，化妝品中奧克立林的不確定度貢獻主要來源于標準溶液的配制及工作曲線的擬合，特別是當對照品稱量較小時，對不確定度影響較大。在試驗過程中可適當增加對照品的取樣量，并做到規(guī)范操作，減小曲線配制過程中產(chǎn)生的不確定度，以保證測量結(jié)果有更高的準確度。

化妝品中防曬劑過量添加會引起光敏性反映，嚴重的可致癌[14]，但目前對于化妝品中防曬劑等限用組分的不確定度評定報道不多，當檢驗結(jié)果出現(xiàn)邊緣值時，本文提出的不確定度評定方法有助于評價化妝品中限用物質(zhì)的含量范圍，為化妝品的風險監(jiān)測提供了參考依據(jù)。