潛陽合劑對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MYH7、ACTA1、BNP mRNA及蛋白表達(dá)的影響

陳 婕，王肖龍

心肌纖維化是心血管疾病發(fā)展到一定程度后的共同病理結(jié)果，其主要發(fā)生機(jī)制是因?yàn)榧?xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂、膠原過度沉積以及各種因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞增殖。心肌纖維化與高血壓、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭、心肌炎等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，肥厚型心肌病心肌纖維化與β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，MYH7)基因突變有關(guān)[4]。MYH7的突變使粗肌絲和細(xì)肌絲的親和力降低，心肌纖維張力下降，導(dǎo)致心肌收縮功能降低，心肌細(xì)胞出現(xiàn)代償性的增殖，最終導(dǎo)致肥厚型心肌病心肌纖維化[5]。Reza等[6]發(fā)現(xiàn)骨骼肌肌動蛋白α1(ACTA1)的基因變異與擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的發(fā)生有關(guān)。ACTA1基因突變會降低編碼蛋白的分子力，使心肌細(xì)胞的收縮力下降，導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病[7]。腦鈉肽(BNP)主要在心室表達(dá)，因心肌纖維化導(dǎo)致心功能不全時BNP可快速合成釋放入血，使血管平滑肌增生，抑制心肌纖維化，調(diào)節(jié)心臟功能。BNP是反映各心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，潛陽合劑可以通過降低血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平來控制血壓和抑制心肌纖維化[9]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，以體外原代培養(yǎng)提純大鼠的心肌細(xì)胞(RCM)為研究對象，通過測定心肌纖維化分子標(biāo)志物MYH7、ACTA1、BNP的蛋白及基因表達(dá)，為進(jìn)一步探討潛陽合劑抑制心肌纖維化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康成年雄性 Wistar 大鼠 12 只，體重 170～200 g，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2016-0004。動物喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)合成飼料，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 中藥制備 熟地黃、鉤藤、女貞子、當(dāng)歸等藥物組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科提供，含生藥1.15 g/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 ACTA1(Bioss公司，bs-10966R)，BNP(Bioss公司，bs-2040R)，MYH7(Bioss公司，bs-10901R)，羊抗兔-HRP(biovol公司，BV-S8008)，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(CWBIO 公司，00051403)，Trizol Reagent(15596-026，invitrogen)，氯仿(AR，國藥)，異丙醇(AR，國藥)，75%無水乙醇(AR，國藥)，DEPC H2O(750024，invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase(R250-01,invitrogen)，熒光染料SYBR Green I(CS7561，invitrogen)，Rnase Inhibitor(E00381，F(xiàn)ermentas)，oligo dT/Random primer/特異性引物(Oligo，invitrogen)，Platinum Taq DNA Polymerase(10966034，invitrogen)，100 mmol/L三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs，18427013，invitrogen)等。

1.4 儀器 Allegra 21R 臺式高速冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司)，臺式高速離心機(jī)(德國SORVAL公司)，Gel Doc2000成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，垂直電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，320-S pH計(jì)(美國Mettler Toledo公司)，AR5120電子天平(美國AHOΜS公司)，MultiTemp Ⅲ 恒溫水浴鍋(日本SANYO公司)，雪花狀制冰機(jī)(日本SANYO公司)，超凈工作臺(中國蘇凈集團(tuán))，高速冷凍離心機(jī)(Neofuge13R，Heal Force)，生物安全柜(HFsafe 1200 A2，Heal Force)，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(CFX96TM Real-Time Systerm，Bio Rad)等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分離培養(yǎng) Wistar 大鼠乳鼠心臟纖維細(xì)胞 取 1～3 d的 Wistar 大鼠乳鼠 12 只，75%乙醇皮膚消毒后剪開胸骨，迅速擠出心臟，快速剪下心臟置于裝有1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)培養(yǎng)皿中。待洗凈后，將心臟組織迅速剪成 1 mm3的組織碎塊。將碎塊組織放入無菌離心管中，用1×PBS 清洗干凈血跡，再將組織塊放入 1×PBS 混合消化酶中(每次 1.5～2.0 mL)，在 37 ℃恒溫水箱中進(jìn)行消化，組織首次消化 10 min，重復(fù)操作，以后每次消化 5～7 min，消化 4次或5 次將上清吸出至 50 mL 離心管中加入培養(yǎng)基[DMEM+5%胎牛血清(FBS)+1%雙抗]中終止消化，直至組織塊消化基本完畢。再經(jīng) 200 目無菌濾網(wǎng)過濾后置于離心管中，1 000 r/min 離心 10 min，棄上清，沉淀加培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于 37 ℃，5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，差速貼壁1.5 h，棄上清后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再更換一次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待心肌細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%后傳代，取第二心臟纖維細(xì)胞作為研究細(xì)胞。

1.5.2 CCK-8(cell counting kit-8)法檢測 CCK-8法檢測AngⅡ誘發(fā)心肌細(xì)胞的增殖，摸索合適的潛陽濃度(拮抗AngⅡ的作用)。用 96 孔板每孔接種 4 000 個 心肌細(xì)胞，于第2天換無血清饑餓處理過夜，后換成 1%FBS 維持培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白組、AngⅡ組(800 nmol/L)、AngⅡ+潛陽合劑組(稀釋1 000 倍)、AngⅡ+潛陽合劑組(稀釋 2 000 倍)、AngⅡ+潛陽合劑組(稀釋 4 000 倍)、AT1R抑制劑組(陽性對照組)，添加適量 CCK-8 溶液，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其光吸收值即 OD490值。觀察潛陽合劑對細(xì)胞的毒性及拮抗 AngⅡ作用的最佳濃度。

1.5.3 分組 心肌細(xì)胞分成空白組、AngⅡ組(800 nmol/L)、AngⅡ+潛陽合劑組(稀釋4 000倍)。

1.5.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測MYH7、ACTA1及BNP蛋白表達(dá) BCA 試劑盒蛋白定量后上樣，10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，1∶500 稀釋MYH7、ACTA1及BNP蛋白抗體分別進(jìn)行免疫蛋白印跡分析，使用 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，并以Actin 為內(nèi)參標(biāo)化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。

1.5.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)檢測MYH7、ACTA1及BNP mRNA表達(dá) 先進(jìn)行RNA樣品提取與質(zhì)檢后再調(diào)整RNA濃度，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行稀釋RNA至統(tǒng)一濃度，然后進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄程序，再將獲得的q-PCR引物(見表1)與獲得的cDNA模板進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增，檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)水平，目的基因的表達(dá)使用相對定量法。ΔCT值=樣本待測基因CT值-相應(yīng)內(nèi)參基因CT值；ΔΔCT值=各組ΔCT值-對照組ΔCT 值；各組待測基因的相對表達(dá)倍數(shù)值=2-ΔΔCT，以該值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 各目的基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的潛陽合劑對AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的潛陽合劑處理后，CCK-8法檢測OD值，潛陽合劑稀釋1 000倍后，對心肌細(xì)胞無毒性(見表2)。800 nmol/L AngⅡ處理后出現(xiàn)心肌細(xì)胞增殖，加入潛陽合劑后，稀釋4 000倍時能很好地拮抗 AngⅡ的作用(見圖1)。

表2 CCK-8 法檢測潛陽合劑對心肌細(xì)胞毒性(OD490值)

圖1 不同濃度潛陽合劑對AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的影響

2.2 3組MYH7、ACTA1及BNP蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，AngⅡ組MYH7、ACTA1及BNP蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05或P<0.01)；與AngⅡ組比較，AngⅡ+潛陽合劑組MYH7、ACTA1、BNP蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)。詳見表3、圖2。

表3 3組MYH7、ACTA1及BNP蛋白表達(dá)比較(±s)

圖2 Western Blot檢測MYH7、ACTA1、BNP蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 3組MYH7、ACTA1及BNP mRNA表達(dá)比較 與空白組比較，AngⅡ組MYH7、ACTA1、BNP mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與AngⅡ組比較，AngⅡ+潛陽合劑組MYH7、ACTA1、BNP mRNA表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 3組MYH7、ACTA1及BNP mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

各種慢性心血管疾病的最終病理改變是以心肌纖維化為特征的心肌組織異常重構(gòu)[10]。但各心血管疾病致心肌纖維化的具體機(jī)制尚不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)肥厚型心肌病基因突變的35%～50%是MYH7基因突變，是我國肥厚型心肌病病人所致心肌纖維化的主要突變基因，也是主要的惡性突變基因[5，11]。心肌細(xì)胞肥大以及間質(zhì)纖維化也是擴(kuò)張型心肌病的主要病理變化。李崢等[12]發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中ACTA1基因突變可導(dǎo)致其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而造成心臟收縮傳導(dǎo)障礙。BNP是公認(rèn)的各心血管疾病終末期心肌纖維化所致心功能下降的評估指標(biāo)，能反映其疾病的預(yù)后。BNP值越高則預(yù)后越差。所以，心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化與MYH7、ACTA1、BNP密切相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、AngⅡ受體拮抗劑、鈣離子拮抗劑(CCB)、醛固酮拮抗劑可以改善心血管疾病所致心肌纖維化的進(jìn)展和預(yù)后，但總體效果有待進(jìn)一步提高[13]。近年來，中藥治療心肌纖維化成為熱點(diǎn)并取得一定成效。

潛陽合劑是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑(滬藥制字Z05100449)，是我院治療高血壓的驗(yàn)方。潛陽合劑主要由熟地黃、鉤藤、女貞子、牡蠣等藥物組成。諸藥均歸肝經(jīng)，可疏肝平肝；熟地、牡蠣歸腎經(jīng)，可滋腎陰、制肝陽。該方以熟地黃、鉤藤、女貞子為君藥滋陰補(bǔ)腎、平肝潛陽；蒺藜為臣藥，增強(qiáng)平肝、滋陰之功效；佐以牡蠣補(bǔ)陰潛陽；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，提高君藥補(bǔ)血滋陰的療效。前期研究發(fā)現(xiàn)，潛陽合劑不僅可以降低血壓，而且可以抑制血管壁膠原蛋白的合成，改善自發(fā)性高血壓大鼠的胸主動脈肥厚性重構(gòu)，還發(fā)現(xiàn)潛陽合劑可以通過降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的沉積改善高血壓左室肥厚的心肌重構(gòu)[14]。因此，潛陽合劑可以改善心肌纖維化所致的心肌重構(gòu)。

本次實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上假設(shè)潛陽合劑改善心肌纖維化與MYH7、ACTA1、BNP的蛋白及基因表達(dá)有關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：潛陽合劑能夠通過降低AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后MYH7 mRNA的表達(dá)，下調(diào)MYH7、ACTA1、BNP蛋白及ACTA1、BNP mRNA表達(dá)來抑制心肌細(xì)胞肥大及纖維化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究為今后潛陽合劑改善心肌纖維化提供了科學(xué)依據(jù)和新的思路。