米諾環(huán)素對(duì)腹透管金黃色葡萄球菌生物膜作用體外研究

鐘煥，黎偉，廖蘊(yùn)華

腹膜透析自1932年成功應(yīng)用以來(lái)，已在臨床應(yīng)用80余年之久，仍是治療慢性腎衰竭的重要方式之一[1]。腹膜炎作為腹膜透析患者最常見嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是引起技術(shù)失敗甚至死亡的最重要原因[2]，原因在于反復(fù)細(xì)菌感染及耐藥的發(fā)生，與細(xì)菌生物膜形成息息相關(guān)[3]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)居腹透相關(guān)性腹膜炎常見革蘭陽(yáng)性菌第2位，約85%的感染與生物膜(biofilm，BF)密不可分[4]。而要解決生物膜治療這一棘手難題，就必須設(shè)計(jì)和研發(fā)一種能在菌株有生物膜的情況下仍有良好的活性和滲透性的新型藥物。米諾環(huán)素屬四環(huán)素類抗生素，研究表明該類抗生素可用于生物膜感染的預(yù)防治療[5]，而目前國(guó)內(nèi)少有報(bào)道米諾環(huán)素治療金黃色葡萄球菌生物膜感染相關(guān)案例。本研究通過(guò)體外觀察米諾環(huán)素對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜起到的作用，為開辟新的腹膜炎治療策略及臨床用藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 BF體外載體的制備：通過(guò)環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌的腹膜透析管(硅膠材料，美國(guó)百特公司生產(chǎn))裁剪成規(guī)格為長(zhǎng)1 cm的小段以備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株：由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供的編號(hào)為34134的經(jīng)臨床微生物檢驗(yàn)中心鑒定的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)臨床菌株作為實(shí)驗(yàn)用菌株。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑和儀器：米諾環(huán)素(sigma公司產(chǎn))，1.5%腹膜透析液(美國(guó)百特公司生產(chǎn))、LB肉湯、LB瓊脂、Mueller-Hinton肉湯(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，戊二醛、硝酸銀、對(duì)苯二酚、硫代硫酸鈉、氯化鈣、氯化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。生化培養(yǎng)箱(spx-300B-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州潔特生物公司)、普通光學(xué)顯微鏡(BH22,日本OLYMPAS)、S-800電子掃描顯微鏡(SEM，日本HITACHI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)菌BF體外模型的制備：按文獻(xiàn)方法并進(jìn)行改良，采用腹膜透析液/LB液—腹透管系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，3 d可培養(yǎng)出早期BF，7 d可培養(yǎng)出成熟BF。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：采用試管二倍稀釋法。參照CLSI(2009年版)，檢測(cè)米諾環(huán)素對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的MIC，平行測(cè)定質(zhì)控菌株ATCC25923。

1.3.2 細(xì)菌BF的鑒定：使用銀染法進(jìn)行菌株鑒定。用無(wú)菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)成功的帶菌腹透管使未黏附的細(xì)菌被洗掉，通過(guò)2.5%戊二醛固定1 h，后用5%硝酸銀溶液染色，最后以1%對(duì)苯二酚溶液進(jìn)行顯色并以5%NaS2O3固定，便可置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.3 對(duì)細(xì)菌BF進(jìn)行掃描電鏡觀察：使用2.5%戊二醛固定腹透管，并漂洗于PBS中，之后使用梯度乙醇進(jìn)行脫水，將金粉在真空中進(jìn)行噴鍍。觀察與攝片條件：電壓30 kV，放大倍數(shù)：3 750。

1.3.4 對(duì)早期和成熟細(xì)菌BF的作用觀察：設(shè)置空白對(duì)照組(生理鹽水組)、1/2MIC米諾環(huán)素組、1MIC米諾環(huán)素組、2MIC米諾環(huán)素組，標(biāo)本數(shù)除生理鹽水組為16份外，其他組均為12份。將帶菌腹透管予生理鹽水多次沖洗去除未黏附細(xì)菌后，分別放入每組的試管中，置于恒溫37 ℃的環(huán)境下進(jìn)行孵育，每間隔4小時(shí)從每組中各拿出腹透管4支，再次行生理鹽水多次沖洗并通過(guò)連續(xù)稀釋法開始平板菌落計(jì)數(shù)。藥物作用達(dá)到24 h后均對(duì)其進(jìn)行銀染和掃描電鏡下觀察。上述實(shí)驗(yàn)操作均進(jìn)行3遍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，不同濃度米諾環(huán)素作用于早期和成熟BF所殘留活菌數(shù)以及在不同時(shí)間段殘留數(shù)以頻數(shù)/百分比表示，比較行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物MIC的檢測(cè)結(jié)果 藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株ATCC25923MIC值均為8 μg/ml。

2.2 銀染法鑒定細(xì)菌BF 帶菌腹透管經(jīng)沖洗掉的細(xì)菌液分別培養(yǎng)3 d與7 d，經(jīng)過(guò)銀染，BF呈分布不均的黑褐色棉絮狀，而且培養(yǎng)7 d后形成的成熟BF更加稠厚。經(jīng)藥物作用24 h后，無(wú)論是早期BF還是成熟BF，1MIC、2MIC米諾環(huán)素組團(tuán)塊狀、棉絮樣的BF明顯少于空白對(duì)照組。見圖1、圖2。

注：a 空白對(duì)照組，b 1MIC米諾環(huán)素組,c 2MIC米諾環(huán)素組圖1 銀染法觀察米諾環(huán)素對(duì)早期BF作用 (銀染×1 000)

注：d 空白對(duì)照組，e 1MIC米諾環(huán)素組，f 2MIC米諾環(huán)素組圖2 銀染法觀察米諾環(huán)素對(duì)成熟BF作用 (銀染×1 000)

2.3 掃描電鏡觀察細(xì)菌BF形態(tài)變化 培養(yǎng)3 d與7 d，掃描電鏡下可見腹透管表面細(xì)菌聚集成簇，形成大片塊狀BF，7 d形成具有立體結(jié)構(gòu)BF，即成熟BF。經(jīng)藥物作用24 h后，無(wú)論是早期BF還是成熟BF，1MIC、2MIC米諾環(huán)素組與空白對(duì)照組相比，BF和菌落體積均有所減少，甚至僅見散在分布單個(gè)菌落。見圖3、圖4。

注：a 空白對(duì)照組，b 1MIC米諾環(huán)素組,c 2MIC米諾環(huán)素組圖3 掃描電鏡觀察米諾環(huán)素對(duì)早期BF作用 (SEM×3 750)

注：d 空白對(duì)照組，e 1MIC米諾環(huán)素組，f 2MIC米諾環(huán)素組圖4 掃描電鏡觀察米諾環(huán)素對(duì)成熟BF作用 (SEM×3 750)

2.4 腹透管表面BF內(nèi)活菌計(jì)數(shù) 無(wú)論是早期BF還是成熟BF，當(dāng)使用米諾環(huán)素4 μg/ml濃度作用于細(xì)菌生物膜時(shí)，4、8、24 h其BF內(nèi)的活菌數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，當(dāng)繼續(xù)增加藥物濃度至8、16 μg/ml，4、8、24 h時(shí)BF內(nèi)活菌數(shù)明顯減少，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但至24 h時(shí)BF內(nèi)的細(xì)菌仍不能被完全清除，分別見表1、表2。

表1 不同濃度米諾環(huán)素對(duì)金黃色葡萄球菌早期BF內(nèi)活菌數(shù)影響

表2 不同濃度米諾環(huán)素對(duì)金黃色葡萄球菌成熟BF內(nèi)活菌數(shù)影響

3 討 論

腹透液具備高糖和低pH等高滲特性，無(wú)疑成為細(xì)菌生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，加之腹透管為硅膠材料，吸附性較強(qiáng)，金黃色葡萄球菌易于腹透管表面形成生物膜。一旦生物膜形成，細(xì)菌有了多聚基質(zhì)保護(hù)，成功躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊及抗菌藥物的殺傷，增加細(xì)菌耐藥性10～1 000倍[6]，且能持續(xù)釋放細(xì)菌，導(dǎo)致腹膜炎反復(fù)發(fā)作或拔管[7]。針對(duì)此，目前國(guó)內(nèi)外重心偏向著力研發(fā)能抑制或消除金黃色葡萄球菌生物膜的滲透性良好且有強(qiáng)烈殺菌作用的抗菌素。

糖肽類抗菌藥物早前已被全世界公認(rèn)為治療金黃色葡萄球菌引起重癥感染首選藥物，其中最為大家熟知代表為萬(wàn)古霉素，但近年來(lái)糖肽類抗生素的耐藥性呈上升趨勢(shì)[8]。研究表明[9]，米諾環(huán)素、達(dá)托霉素可破壞已形成的BF，并可清除其內(nèi)部的金黃色葡萄球菌，甚至提出在這方面的作用完全優(yōu)于萬(wàn)古霉素、替考拉寧。因此大膽設(shè)想米諾環(huán)素也許是治療金黃色葡萄球菌感染的不錯(cuò)選擇。米諾環(huán)素為半合成四環(huán)素類，在四環(huán)素第7位引進(jìn)2個(gè)甲基，具備高度的親脂性、較強(qiáng)的組織穿透力及良好的抗菌作用。研究指出[10]，米諾環(huán)素對(duì)生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的菌株的抗菌作用強(qiáng)度幾乎相同。臺(tái)灣的研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素還可對(duì)已形成的金黃色葡萄球菌生物膜進(jìn)行破壞并且可及時(shí)清除BF內(nèi)金黃色葡萄球菌[11]。

筆者前期實(shí)驗(yàn)成功在體外環(huán)境下使腹透管—腹透液系統(tǒng)的金黃色葡萄球菌生物膜模型成功建立，3 d形成早期膜，7 d則為成熟膜。本研究則在此基礎(chǔ)上針對(duì)不同濃度米諾環(huán)素在通過(guò)生物膜和殺滅其內(nèi)菌株的作用進(jìn)行相關(guān)研究?；趥鹘y(tǒng)的MIC治療策略，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(生理鹽水組)、1/2MIC米諾環(huán)素組、1MIC米諾環(huán)素組、2MIC米諾環(huán)素組，分別觀察其對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜體外作用。結(jié)果顯示，無(wú)論對(duì)早期膜還是成熟膜，當(dāng)米諾環(huán)素濃度為4 μg/ml(即1/2MIC)時(shí)，即使延長(zhǎng)作用時(shí)間至24 h，其BF內(nèi)的活菌數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明此時(shí)米諾環(huán)素對(duì)生物膜毫無(wú)作用，而逐漸增加藥物濃度至8、16 μg/ml時(shí)，4、8、24 h再次通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其BF內(nèi)的活菌數(shù)較前減少，表明一旦達(dá)到有效濃度，藥物可破壞生物膜，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其內(nèi)活菌數(shù)有減少趨勢(shì)。使用藥物達(dá)24 h后，1MIC、2MIC米諾環(huán)素組的早期膜和成熟膜實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)過(guò)銀染法、掃描電鏡觀察后，所顯示的腹透管表面BF體積及菌落數(shù)均明顯少于空白對(duì)照組，再次有力證實(shí)這一結(jié)果。

綜上所述，米諾環(huán)素濃度增加，只要達(dá)到有效作用濃度或以上，伴隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，讓累積藥物濃度逐漸上升，可大幅度減少細(xì)菌生物膜和細(xì)菌數(shù)量，具有強(qiáng)大的殺菌效能，給臨床治療腹透相關(guān)性腹膜炎提供又一方便及可行治療措施，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)警惕在臨床工作中一旦使用敏感抗生素控制感染，一定使血藥濃度和療程足夠充分才能發(fā)揮最大效能，否則容易導(dǎo)致更加嚴(yán)重的感染以及誘發(fā)細(xì)菌耐藥。