前列腺干細胞抗原及其單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的表達與檢測

尚國富，劉江麗，于 歡，唐開義，曾 柱,3，胡祖權,3，王 赟

前列腺癌是男性常見的癌癥，也是男性癌癥死亡三大原因之一[1]。前列腺癌的患病率在我國呈現(xiàn)迅速上升的趨勢，該癌癥成為危害我國男性健康的重要疾病[2]。因此，建立快速、有效的前列腺癌檢測技術體系，對于臨床診斷和治療具有重要作用。前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是一種糖基磷脂酰肌醇錨定細胞表面蛋白，在前列腺組織中的表達有很高的特異性，其表達水平在前列腺癌組織中顯著高于正常前列腺組織[3]。因此，PSCA被認為是診斷和預后前列腺癌的生物標志物，也是治療的理想靶點[3-4]。該研究分別構建PSCA以及抗PSCA單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)融合蛋白的原核表達體系，大量表達并檢測其活性，為后期發(fā)展基于融合蛋白的免疫檢測技術提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌XL1-Blue、pET-32a載體及pDAP2/S載體由華中農業(yè)大學分子生物技術實驗室饋贈。pET-32a載體含有TrxA基因，PSCA基因構建到該載體中可誘導表達重組TrxA-PSCA融合蛋白，pDAP2/S載體含有AP基因，PaFv基因構建到該載體中可誘導表達重組PaFv-AP融合蛋白。T4 DNA連接酶、Taq聚合酶、RNAase、DNA Marker購自日本Takara公司；Tryptone、Yeast extract購自英國Oxoid公司；DNA凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；BCIP/NBT顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白Marker購自美國Thermo-Fisher公司；抗His單克隆抗體、AP標記羊抗小鼠特異抗體、對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白質定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 PCR引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的PSCA基因序列，利用Primer Primer 5.0軟件設計擴增PSCA成熟肽序列的引物，引物(表1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 本研究引物序列表

1.3PSCA基因的擴增和PaFv基因的合成培養(yǎng)前列腺癌細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，采用Oligo(dT)12-18引物反轉錄合成cDNA，再利用特異引物PHisF/PHisB進行PCR擴增獲得PSCA基因。在50 μl反應體系中，分別加入2 μl cDNA、PHisF、PHisB和dNTPs，5 μl 10× PCR Buffer，0.5 μl Taq酶；PCR擴增反應條件為： 95 ℃預處理5 min； 94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、80 s，30個循環(huán)；72 ℃、10 min。取2 μl PCR產物通過1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

為了提高抗PSCA單鏈抗體PaFv的原核表達效率，根據(jù)大腸桿菌的遺傳密碼偏愛性，利用GenSmart Codon Optimization工具優(yōu)化PaFv的密碼子，由金斯瑞生物科技公司合成，同時在基因的5′端添加SfiI限制酶酶切位點，在3′端同時添加218連接肽和NotI限制酶酶切位點。

1.4 基因克隆與陽性克隆鑒定用BamHI和XhoI分別酶切PSCA目的基因和pET-32a載體，通過瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，再在T4 DNA連接酶的作用下將目的基因連入載體中，獲得可用于原核表達的pET-32a-PSCA重組載體。經熱激法轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含有Amp (100 μg/ml)的LB培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)15 h。挑取單克隆培養(yǎng)并利用載體特異引物TF/T7t進行PCR擴增檢測，根據(jù)DNA條帶大小鑒定陽性克隆，送公司測序驗證。

用SfiI和NotI內切酶分別切割pDAP2/S載體的質粒DNA和PaFv目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，再在T4 DNA連接酶的作用下將目的基因連入載體中，獲得可用于原核表達的pDAP2/S-PaFv重組載體。經熱激法轉化至XL1-Blue大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布于含有Amp (100 μg/ml)的LB培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單克隆培養(yǎng)并利用載體特異引物pDAP2-Spel/pDAP2-Sap進行PCR擴增鑒定，陽性克隆送公司測序驗證。

1.5 TrxA-PSCA融合蛋白的原核表達與純化取20 μl甘油保存的重組菌株BL21(DE3)/pET-32a-PSCA接種于20 ml含100 μg/ml Amp的2TY液體培養(yǎng)基[5]中，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)后，取16 ml菌液接種至800 ml含100 μg/ml Amp的2TY培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)使其OD600 nm達到0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)，繼續(xù)誘導表達5 h。超聲波破碎提取TrxA-PSCA融合蛋白，在4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，取菌液上清液利用Ni-NTA基質純化。純化后的TrxA-PSCA融合蛋白經BCA定量試劑盒定量后，取4 μg上樣進行SDS-PAGE檢測。

1.6 PaFv-AP融合蛋白的原核表達取20 μl甘油保存的XL1-Blue/pDAP2/S-PaFv重組菌液，接種于20 ml含有100 μg/ml Amp的2TY液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床200 r/min培養(yǎng)12 h。取10 ml菌液轉接到200 ml新鮮的含有100 μg/ml Amp的2TY培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床200 r/min培養(yǎng)使其OD600 nm達到0.5～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達。在20 ℃條件下200 r/min誘導培養(yǎng)14 h。4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入15 ml PBS緩沖液重懸菌體[5]，經超聲波破碎處理后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液。

1.7 Western blot分析取20 μl XL1-Blue/pDAP2/S-PaFv重組大腸桿菌大量表達的總蛋白經10%SDS-PAGE電泳后，利用半干轉印儀將凝膠中的蛋白轉印到NC膜上，放入5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h后，再用1 ∶5 000稀釋的抗His單克隆抗體室溫孵育2 h，AP標記的二抗室溫孵育2 h，最后用BCIP/NBT顯色試劑顯色。

1.8 AP顯色反應及ELISA檢測PaFv-AP融合蛋白的活性原核表達的PaFv-AP融合蛋白通過AP顯色反應快速檢測融合蛋白的AP活性[5]，再通過ELISA反應檢測融合蛋白的抗原結合特性。用PBS稀釋TrxA-PSCA蛋白至20 ng/μl，取100 μl加入ELISA板孔中，37 ℃孵育2 h，PBS作為空白對照。加入200 μl PBS洗板3次后，每孔加入200 μl 2% (W/V) BSA溶液，37 ℃封閉2 h。甩干ELISA板中的封閉液，每孔加入200 μl PBS洗板3次。隨后，每孔加入100 μl表達的PaFv-AP融合蛋白(20 ng/μl)，37 ℃孵育1.5 h。用200 μl PBST和PBS分別洗滌3次后，加入100 μl 0.2%(W/V) pNPP顯色液，黑暗條件下反應后用酶標儀在405 nm波長下測定OD值。

2 結果

2.1 目的基因的獲取以cDNA為模板，利用特異引物通過PCR擴增獲得PSCA目的基因，凝膠電泳檢測顯示目的片段約250 bp (圖1A)，與預期的大小一致。另外，根據(jù)大腸桿菌的遺傳密碼子的使用頻率，優(yōu)化抗PSCA單鏈抗體的編碼基因，并添加內切酶酶切位點和218連接肽，合成PaFv基因片段，凝膠電泳檢測結果如圖1B所示，目的基因片段與預期的約850 bp相一致。

圖1 PSCA基因及PaFv基因的電泳圖

2.2 原核表達載體的構建重組載體pET-32a-PSCA轉化大腸桿菌BL21(DE3)后，隨機挑取5個單克隆轉化子，PCR擴增結果顯示5號克隆擴增出的DNA條帶大小與預期一致(圖2A)。公司測序結果確證PSCA基因成功構建到pET-32a載體中。重組載體pDAP2/S-PaFv轉化大腸桿菌XL1-Blue后，PCR擴增結果顯示1-3號克隆擴增出的DNA條帶清晰明亮(圖2B)。測序結果確證成功獲得含有pDAP2/S-PaFv重組質粒的陽性轉化子。

圖2 PCR鑒定陽性轉化子

2.3 蛋白的原核表達與檢測重組菌株BL21(DE3)/pET-32a-PSCA在37 ℃、200 r/min條件下，0.5 mmol/L IPTG誘導表達5 h，純化后獲得的TrxA-PSCA融合蛋白濃度為0.40 mg/ml。SDS-PAGE電泳檢測結果如圖3A所示，在約28 ku處出現(xiàn)單一的目的條帶，獲得了純度約85%的可溶性TrxA-PSCA融合蛋白。含有pDAP2/S-PaFv重組質粒的大腸桿菌通過IPTG誘導表達，超聲波破碎處理提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳和Western雜交檢測。結果顯示有單一的約90 ku大小的蛋白條帶(圖3B)，與PaFv-AP融合蛋白的分子量相一致。

2.4 PaFv-AP融合蛋白的活性分析AP顯色反應顯示原核表達的PaFv-AP融合蛋白能夠快速催化pNPP底物顯色，其顯色值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-67.945，P<0.001) (圖4)。實驗組平均讀值為對照組9.2倍，說明融合蛋白可溶性表達并具有很強的AP活性。在ELISA孔中包被TrxA-PSCA重組蛋白，加入原核表達的PaFv-AP融合蛋白進行ELISA檢測(圖4)，PaFv-AP融合蛋白的OD405 nm值與對照組相比，平均讀值相差3.2倍，差異有統(tǒng)計學意義(t=-28.946，P<0.001)，表明原核表達的PaFv-AP融合蛋白保留scFv和AP的活性，可用于PSCA蛋白的免疫學檢測。

圖3 TrxA-PSCA和PaFv-AP融合蛋白的表達鑒定

圖4 AP顯色反應和ELISA檢測PaFv-AP融合蛋白的活性

3 討論

PSCA是一種前列腺癌腫瘤相關抗原，由Reiter et al[3]在1998年研究前列腺癌的基因表達過程中發(fā)現(xiàn)。近年來的研究[3-4，6]表明PSCA的表達與前列腺癌患者的預后密切相關，可作為前列腺癌預后的指標以及晚期患者的治療靶標。本研究克隆了人PSCA成熟肽的編碼基因序列(78～314 bp)，通過與促溶蛋白標簽TrxA融合表達TrxA-PSCA蛋白作為免疫檢測的抗原。

免疫學檢測方法具備特異性好、靈敏度高、價格低廉和操作簡單等優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛應用于疾病診斷及毒素檢測分析等[7-9]。scFv是通過基因工程技術制備的具有完全抗原結合位點的最小抗體片斷，對靶抗原的結合活性與天然抗體十分接近[10]。由于scFv的特殊小分子結構，蛋白糖基化修飾對其活性功能影響較小，可在大腸桿菌等原核生物中高效表達，純化過程和操作簡單[11]。更重要的是，scFv基因可根據(jù)表達的宿主細胞進行密碼子優(yōu)化來提高表達量、可溶性和活性等，也可在體外進行設計改造或與AP、細胞因子等蛋白質的編碼基因通過基因工程操作融合表達，從而改變或增加scFv的特性[12-13]。scFv-AP融合蛋白用于抗原檢測時不需要添加酶標記二抗，從而使免疫學檢測過程大大加速，檢測成本顯著下降，應用前景十分廣泛[5]。

本研究確定在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，37 ℃誘導培養(yǎng)5 h能夠獲得大量可溶性表達的TrxA-PSCA融合蛋白；在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，20 ℃誘導培養(yǎng)14 h能夠高效可溶性表達PaFv-AP融合蛋白。AP顯色反應和ELISA分析結果顯示原核表達的PaFv-AP融合蛋白保留了scFv和AP的活性，但尚未達到檢測應用的要求，后續(xù)將進一步優(yōu)化表達條件后通過發(fā)酵大量生產融合蛋白，或通過分子建模和定點突變等技術提高融合蛋白的活性。本研究通過基因工程操作技術實現(xiàn)了PSCA抗原和PaFv-AP融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，為后續(xù)前列腺癌免疫診斷的應用研究奠定了實驗基礎。