繡球菌水溶性多糖的硫酸化修飾及其對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激活性*

張 迪，王宏雨，林衍銓

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，繡球菌中含有大量的活性多糖，能夠提高人體免疫力及機(jī)體造血能力，并能預(yù)防和抑制腫瘤[1-4]。前人的研究中提取的繡球菌活性多糖，多為采用堿溶液提取的，難溶性或不溶性多糖，其一級(jí)結(jié)構(gòu)是具有1，6分支結(jié)構(gòu)的β-1，3-葡聚糖，大約每3個(gè)主鏈單元中有1個(gè)分支[5]。

硫酸化修飾被認(rèn)為是有效的多糖改性方法，硫酸化多糖也稱多糖硫酸酯，是指多糖鏈上的羥基被生物體自然生成或人工合成的硫酸基團(tuán)取代，而形成的改性多糖[6]。多糖硫酸化常用的方法有wolfrom法、nagsawa法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法及三氧化硫-二甲基甲酰胺法等。吡喃型多糖的硫酸酯化多采用wolfrom法，用磺酰氯與吡啶的混合物作為硫酸酯化試劑對(duì)多糖進(jìn)行硫酸酯化。目前的研究結(jié)果表明[7-8]，多糖的硫酸化修飾常常能帶來部分活性功能的提升或增加，這主要緣于硫酸基團(tuán)的引入導(dǎo)致的多糖的物理性質(zhì)和活性結(jié)構(gòu)特性的改善。

目前對(duì)繡球菌活性多糖的研究，主要集中于大分子量的難溶性β-葡聚糖，對(duì)其可溶性多糖的結(jié)構(gòu)和活性尚缺乏系統(tǒng)和深入的研究。課題組在前期研究中從繡球菌凍干品提取到一種分子量為400 KDa的可溶性多糖[9]，試驗(yàn)以該水溶性多糖為研究對(duì)象，通過wolfrom法對(duì)其進(jìn)行硫酸化修飾，并采用鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激試驗(yàn)對(duì)其硫酸化修飾前后的體外免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了比較分析，以期填補(bǔ)相關(guān)研究工作的空白，為繡球菌多糖的修飾改性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

繡球菌子實(shí)體鮮品由福建天益菌業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)康寧公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；FBS50，美國(guó)依科賽生物科技有限公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)；96孔板，美國(guó)康寧股份有限公司公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純、色譜純；試驗(yàn)用水為超純水。

Nicolet6700紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；IX51倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CO2培養(yǎng)箱，三洋電機(jī)株式會(huì)社；Centrifuge 5804-R離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；EPOCH2TC酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 繡球菌水溶性多糖的制備

以凍干繡球菌為提取原料，按參考文獻(xiàn)[9]所述方法，采用熱水提取法進(jìn)行水溶性多糖的提取制備。

1.3.2 繡球菌水溶性多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離

取20 mg·mL-1的繡球菌多糖溶液10 mL上樣于DEAE Sepharose Fast Flow柱 （2.6 cm×25.0 cm） 進(jìn)行分離。前15管用純水洗脫，而后用0.05 mol·L-1的NaCl溶液洗脫。流速1 mL·min-1，分部收集器收集流份5 mL/管。以無水乙醇跟蹤檢測(cè)各管中多糖，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各流份。含鹽流份用透析袋流水透析48 h脫鹽后凍干保藏。

1.3.3 繡球菌多糖組份的硫酸化修飾

采用氯磺酸-吡啶法對(duì)繡球菌多糖進(jìn)行硫酸酯化[11]。將吡啶2 mL加入接有冷凝裝置的10 mL長(zhǎng)頸燒瓶中，將燒瓶置于冰水燒杯中預(yù)冷30 min后，在冰水浴冷卻和振蕩條件下，用移液器向燒瓶中緩慢滴加氯磺酸1.25 mL，約5 min內(nèi)滴加結(jié)束。控制反應(yīng)體系溫度在常溫下，反應(yīng)至燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，無白煙冒出時(shí)，取出燒瓶。稱取多糖100 mg，二甲基甲酰胺用5 mL充分溶解后移入長(zhǎng)頸燒瓶中。將燒瓶置于90℃的水浴鍋中反應(yīng)3 h，其間不時(shí)振蕩搖勻。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用10 mL冰水將反應(yīng)物溶出至100 mL燒杯中，用2.5 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，用4倍體積無水乙醇醇沉過夜，離心收集沉淀。將沉淀溶于適量蒸餾水中，用去離子水透析72 h，透析液冷凍干燥即得到硫酸化繡球菌多糖。

1.3.4 繡球菌硫酸化多糖的硫酸基取代度測(cè)定

采用氯化鋇-明膠濁度法測(cè)定硫酸基含量[10]，并計(jì)算硫酸取代度。

1.3.5 繡球菌硫酸化多糖的紅外光譜分析

分別稱取2 mg樣品與適量的KBr粉末在白熾燈下干燥研磨均勻，壓片機(jī)壓片，紅外光譜儀在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描透射光譜進(jìn)行紅外分析。

1.3.6 多糖樣品的體外鼠脾淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)

通過MTT法檢測(cè)水溶性多糖SCG-A、SCG-N和其硫酸化產(chǎn)物SCG-AS、SCG-NS對(duì)大鼠活體分離的第一代脾淋巴細(xì)胞體外增殖刺激活性[11]。

脾臟淋巴細(xì)胞制備：無菌操作下取出大鼠脾臟，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS） 漂洗后將脾臟組織剪碎，冷PBS漂洗后加入0.125%胰酶+0.05%II型膠原酶進(jìn)行消化；消化完成后過濾，濾液通過梯度離心收集淋巴細(xì)胞，收集的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后于RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清中培養(yǎng)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將脾淋巴細(xì)胞消化、調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用，在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；然后置于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)；24 h后每孔加入含各濃度多糖的培養(yǎng)基100 μL，再于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)72 h；然后進(jìn)行MTT染色，測(cè)定490 nm的OD值，計(jì)算各組別增殖率，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)陰性對(duì)照組。細(xì)胞增值率（Z，%）的計(jì)算公式為：

式中：OD為處理組OD值；COD為對(duì)照組OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離

繡球菌多糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱層析后的洗脫曲線見圖1。

由圖1所示，根據(jù)繡球菌多糖的DEAE Sepharose Fast Flow凝膠層析洗脫曲線圖，5管～16管為不被凝膠柱吸附的穿透峰，收集該部分流份命名為SCG-N,19-24管部分為被凝膠柱吸附的NaCl溶液洗脫峰，收集該部分流份，透析脫鹽后命名為SCG-A，然后分別對(duì)其進(jìn)行硫酸化修飾。

2.2 硫酸化修飾的繡球菌多糖的得率和硫酸基取代度測(cè)定

硫酸基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2所示，以硫酸鉀為硫酸基取代度測(cè)定的硫酸基標(biāo)樣，測(cè)定硫酸基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程計(jì)算公式為：

式中：Y為溶液中硫酸基濃度（mg·mL-1）；X為360 nm波長(zhǎng)下的吸光度。R2=0.998，線性擬合良好。硫酸基取代度（DS）計(jì)算公式為：

式中：S（%） 為硫酸基的含量（%）[10]。

計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 繡球菌多糖的硫酸化修飾的產(chǎn)率及其硫酸基取代度Tab.1 The yield of sulfated modification of polysaccharide and its degree of substitution

由表1可知，通過硫酸基取代度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，中性糖SCG-N硫酸化修飾后的硫酸基含量和取代度都顯著高于酸性糖SCG-A。

2.3 繡球菌硫酸化多糖的紅外光譜分析

SCG-A及其硫酸化衍生物SCG-AS的FT-IR圖譜見圖3。

由圖3可知，SCG-A的吸收譜帶在3 397.09 cm-1處有強(qiáng)且寬的吸收峰，系由多糖上的羥基產(chǎn)生；2 927.73 cm-1附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動(dòng)的信號(hào)，中等強(qiáng)度；1 647.47 cm-1處為酰胺羰基特征吸收峰，可見樣品中可能有一定量的糖結(jié)合蛋白；1 154.86 cm-1、1 080.86 cm-1、1 023.46 cm-13 個(gè)峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，光譜在890 cm-1附近無吸收峰，而在850 cm-1有一吸收峰表明其糖苷鍵構(gòu)型主要為α型。從硫酸化樣品SCG-AS的紅外圖譜可以看出，在1 235.84 cm-1處有一強(qiáng)的吸收峰，為S=O的伸縮振動(dòng)峰，證明其已被成功硫酸化修飾。

SCG-N及其硫酸化衍生物SCGNS的FT-IR圖譜見圖4。

由圖4可知，SCG-N的紅外光譜由于多糖中羥基的伸縮振動(dòng)在3 300 cm-1處有強(qiáng)吸收，2 926 cm-1處的吸收歸因于C-H鍵的伸縮振動(dòng)，1 000 cm-1～1 100 cm-1間為吡喃糖環(huán)的特征峰，890 cm-1與850 cm-1附近均有吸收峰，可見其中既含有β型吡喃糖苷鍵也含有α型吡喃糖苷鍵。SCG-NS的紅外光譜在1 243.60 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)吸收峰，該峰為S=O的伸縮振動(dòng)峰，表明SCG-N已被成功地硫酸化修飾。

2.4 繡球菌多糖硫酸化修飾前后對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激活性

經(jīng)MTT法72 h處理的SCG-A和SCG-AS對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響見圖5。

由圖5、圖6可知，硫酸化修飾后的SCG-AS和SCG-NS在低濃度處理下，二者促進(jìn)增殖的刺激活性都有顯著的提高，SCG-N硫酸化修飾后對(duì)其活性的提升較SCG-A顯著，SCG-N原在50 μg·mL-1濃度下檢測(cè)不到刺激活性，但經(jīng)硫酸化修飾后其硫酸化產(chǎn)物SCG-NS細(xì)胞增殖率提高為50.22%，表現(xiàn)出很強(qiáng)的刺激活性。但在高濃度處理組，硫酸化修飾多糖SCG-AS（>200 μg·mL-1）、SCG-NS（>400 μg·mL-1）促進(jìn)增殖的刺激活性并未繼續(xù)提高，反而出現(xiàn)了下降。

3 結(jié)果與討論

目前對(duì)繡球菌多糖的研究主要以其β-葡聚糖為研究對(duì)象，對(duì)其可溶性多糖的研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以前期從凍干品繡球菌中提取分子量約400 KDa的可溶性多糖為研究對(duì)象[9]，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱分離得到SCG-A和SCG-N多糖組份，經(jīng)紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)SCG-A為α型酸性多糖，而中性糖組份SCG-N同時(shí)含有α、β多糖，由此可見繡球菌可溶性糖主要以α型多糖構(gòu)成。通過硫酸基取代度測(cè)定發(fā)現(xiàn)中性糖SCG-N硫酸化修飾后的硫酸基含量和取代度都顯著高于酸性糖SCG-A，這可能與其糖鏈中可供酯化的羥基數(shù)量更多有關(guān)。

通過大鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激活性測(cè)試比較了水溶性多糖SCG-A、SCG-N與其硫酸化產(chǎn)物SCGAS、SCG-NS的體外免疫活性差異。檢測(cè)結(jié)果顯示，未硫酸化前SCG-A、SCG-N均具有不同程度的促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的活性，SCG-A對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用較好，在最低濃度50 μg·mL-1下仍可以觀察到明顯的促進(jìn)作用，增殖率為21.78%，且在50 μg·mL-1～800 μg·mL-1的范圍內(nèi)存在明顯劑量依賴關(guān)系；相比之下SCG-N的活性較差，在50 μg·mL-1低濃度處理時(shí)基本觀察不到促進(jìn)效果。硫酸化修飾后，在低濃度處理時(shí)，SCG-AS、SCG-NS對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞的體外促進(jìn)增殖的刺激活性都有了顯著的提高，SCG-NS的提升幅度要強(qiáng)于SCG-AS，提升的幅度可能與硫酸化產(chǎn)物的硫酸基取代度有一定的關(guān)系，同時(shí)高濃度處理組刺激活性的下降，也可能與高濃度的硫酸基團(tuán)的抑制或毒性作用有關(guān)，這些都有待進(jìn)一步研究。