薄層色譜法檢測大豆皂苷的條件優(yōu)化

范姝姝 ，徐海軍 ，杜維俊 ，趙晉忠 ，岳愛琴

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)部，山西太谷030801）

大豆皂苷是大豆中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，具有多種對人體有益的生物活性，如抗癌[1-2]、抗病毒[3]、抗血脂[4]，對人結(jié)腸癌細胞的抗增殖作用[5-6]，以及通過分泌甲狀腺激素減少肝臟脂質(zhì)過氧化[7]。其主要分布在大豆種子中，含量為0.6%～6.2%[8]。大豆皂苷屬于五環(huán)三萜類齊墩果酸型，由非極性的三萜苷元大豆皂醇A、皂醇B 和β-D- 葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D- 木糖、β-D- 葡萄糖醛酸、α-L- 鼠李糖、α-L- 阿拉伯糖6 種糖基及其乙?；腔冉M成[9-10]。根據(jù)苷元不同可將大豆皂苷分為A 類、B 類、DDMP 類、E 類[11-12]。A 類皂苷是大豆皂醇 A 的 C-3和C-22 位上結(jié)合了2 個糖基鏈。目前，A 類皂苷根據(jù) C-22 糖苷的不同分為 3 個系列：Aa 系列（Aa、Au、Ae、Ax、Ay、Ag）、Ab 系列（Ab、Ac、Af、Ad、Az、Ah）和 A0 系列（A0-αg、A0-βg、A0-γg、A0-αa、A0-βa、A0- γa）[13-15]。

目前，對大豆皂苷定性分析的方法有薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）[16]、高效液相色譜法[17-18]等。HU 等[19]利用高效液相色譜法檢測已知大豆皂苷組分，但此方法需要昂貴的儀器。TLC 法是一種定性分析少量物質(zhì)的一種主要的實驗技術(shù)，該方法是根據(jù)不同的分析物質(zhì)與固定相、流動相的親和性不同，從而具有不同的遷移率進行分離[20]。TLC 可以同時分析多個樣品，且不需要復雜的儀器，分析成本低，方法簡單，結(jié)果可直接觀察[21]。但采用的薄層色譜法檢測大豆皂苷存在邊緣效應，比如譜帶丟失或拖尾現(xiàn)象，尤其是譜圖中低聚糖區(qū)與皂苷區(qū)相互干擾。因此，對現(xiàn)有TLC 法進行優(yōu)化，以確保其檢測的準確性。

本研究主要通過對TLC 法展開劑配比、展開時間、點樣量、展開溫度、預飽和時間以及顯色條件進行優(yōu)化，建立一種TLC 法快速檢測大豆皂苷的方法，并對20 個大豆材料皂苷類型進行分析，旨在為今后大豆皂苷特異種質(zhì)的篩選和改良提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大豆材料均由山西農(nóng)業(yè)大學大豆育種室提供（表 1）。

表1 供試大豆材料名稱和皂苷類型

大豆皂苷標準品 Aa（≥98%，HPLC）、Ab（≥98%，HPLC）、Ba（≥98%，HPLC）、Bb（≥98%，HPLC）購于成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

甲醇、氯仿、乙醇、冰乙酸、甲酸、石油醚（沸程為60～90 ℃）均為分析純，購于天津市永大化學試劑有限公司。GF-254 硅膠板，購于青島裕民源硅膠試劑廠。

震動研磨儀（北京格瑞曼儀器設(shè)備有限公司）、移液槍（廣州市昕迪實驗器材有限公司）、電子天平（深圳市銘科科技有限公司）、數(shù)顯恒溫水箱（金壇市新航儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 將大豆胚、子葉、種皮、莖、葉、根冷凍干燥，球磨儀磨成粉末，過0.42 mm 篩備用。

胚、子葉、根、莖、葉置于含0.01%乙酸的70%乙醇水溶液中室溫浸提24 h，離心取上清，用2 倍體積的石油醚萃取脫脂，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標準溶液的制備 準確稱取大豆皂苷標準品 Aa、Ab、Ba、Bb 各 1 mg，分別溶于 1 mL 甲醇，配成1 mg/mL 標準溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 薄層色譜條件的優(yōu)化

1.3.3.1 展開劑的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，通過改變展開劑配比（表2）考察了4 種展開劑對反應結(jié)果的影響。

表2 大豆皂苷展開劑配比

1.3.3.2 展開時間的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，通過改變展開時間考察了4 個展開時間（30、50、70、90 min）對反應結(jié)果的影響。

1.3.3.3 點樣量的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，通過改變胚提取液的點樣量考察了7 個點樣量（2、4、6、8、10、12、14 μL）對反應結(jié)果的影響。

1.3.3.4 展開溫度的優(yōu)化 采用優(yōu)化后的點樣量和展開劑條件下，通過改變展開溫度考察了4 個溫度（20、25、30、35 ℃）對反應結(jié)果的影響。

1.3.3.5 預飽和時間的優(yōu)化 采用優(yōu)化后的薄層色譜條件，通過改變預飽和時間考察了4 個預飽和時間（0、30、60、90 min）對結(jié)果的影響。

1.3.3.6 顯色條件的優(yōu)化 采用優(yōu)化后的薄層色譜條件，通過改變顯色時間考察了4 個TLC 板在10%的 H2SO4溶液中浸泡時間（0、3、5、8 min）對顯色結(jié)果的影響。

1.3.4 驗證優(yōu)化后的TLC 法 檢測大豆皂苷的準確性和適用性，并對20 種不同大豆材料胚的大豆皂苷提取液進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 展開劑和展開時間的優(yōu)化分析

由圖1 可知，4 種展開劑均可以將異黃酮、皂苷和低聚糖分離。已知展開劑、展開劑1、展開劑3 的大豆皂苷條帶均有拖尾現(xiàn)象，分離效果差；而展開劑2 可以得到清晰的皂苷條帶，分離效果較好，因此，選擇展開劑2 為TLC 最佳展開劑。

從圖 1 可以看出，展開時間為 30、50 min 時，大豆皂苷譜帶分離效果不好；展開時間為70 min 時，各組分譜帶分離明顯，且無譜帶丟失現(xiàn)象；展開時間為90 min 時，微量組分譜帶模糊，所以，展開時間70 min 為TLC 法檢測大豆皂苷最佳展開時間。

2.2 點樣量的優(yōu)化分析

從圖2-A 可以看出，子葉提取液點樣量為2、4、6、8 μL 時，含量少的譜帶不顯色；點樣量為 10 μL時，分離度效果好，可以觀察到所有譜帶。由圖2-B可知，胚提取液點樣量為2、6 μL 時，弱帶不顯色；點樣量12、14 μL 時產(chǎn)生拖尾，各條帶變寬而發(fā)生重合，所以，子葉和胚點樣量均為10 μL 是最佳點樣量。

2.3 展開溫度的優(yōu)化分析

由圖3 可知，展開溫度為20、25 ℃時，遷移距離小，譜帶分不開；展開溫度為30 ℃時，譜帶能較好地分離，且色譜圖重復性好；展開溫度為35 ℃時，譜帶遷移距離相對較大，且色譜圖不穩(wěn)定。所以，最佳展開溫度選擇30 ℃。

2.4 預飽和時間的優(yōu)化分析

從圖4 可以看出，顯色前如果不進行預飽和，TLC 板會產(chǎn)生邊緣效應；預飽和時間為30 min 時，無邊緣效應，且皂苷各組分譜帶清晰；延長預飽和時間為60、90 min 時，譜帶模糊。所以，預飽和時間30 min 為最佳預飽和時間。

2.5 顯色條件的優(yōu)化分析

從圖5 可以看出，TLC 板未經(jīng)10%的H2SO4顯色溶液浸泡時，由于低聚糖譜帶顏色深且緊鄰皂苷譜帶，對皂苷顯色產(chǎn)生干擾；顯色液中浸泡3 min 時低聚糖顏色變淺，且得到清晰的皂苷譜帶；浸泡5、8 min 時，因顯色時間過長，皂苷譜帶顏色變淺，含量少的皂苷譜帶不顯色。所以，選擇10%的H2SO4溶液中浸泡3 min 為最佳顯色條件。

2.6 TLC 法檢測大豆皂苷的準確性分析

從圖6 可以看出，4 種大豆皂苷標準品和3 個樣品均有較好的分離效果，且譜帶清晰。樣品譜帶與標準品譜帶進行對照，可以確定大豆材料皂苷的類型。

2.7 檢測大豆皂苷適用性分析

利用優(yōu)化的TLC 法對20 個大豆材料進行大豆皂苷組成分析，結(jié)果表明（圖7），第一泳道晉大53和第8 泳道SNWS47 皂苷類型屬于Ab 型皂苷，其他大豆材料均屬于Aa 型。第4 泳道晉豆19 有2 條譜帶，而其他材料至少有3 條譜，表明不同大豆材料胚中所含的大豆皂苷組分存在差異。

3 結(jié)論與討論

張倩等[22]建立了TLC 法檢測野生大豆皂苷展開體系，但其展開過程必須在10 ℃以下完成，否則會影響分離效果。本研究對TLC 檢測大豆皂苷的展開劑配比、展開時間、點樣量、展開溫度、預飽和時間以及顯色條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，展開劑為氯仿∶甲醇∶水∶甲酸＝65∶38∶10∶0.01（V/V），展開時間 70 min，點樣量 10 μL，展開溫度 30 ℃，預孢和時間30 min，在10%的H2SO4溶液中浸泡3 min為最優(yōu)條件。為了驗證優(yōu)化后的TLC 法檢測大豆皂苷的準確性和適用性，對大豆皂苷標準品和20 個大豆材料皂苷類型進行了分析，證明該優(yōu)化體系可以快速、準確地檢測大豆皂苷類型。該方法可用于快速檢測大豆種質(zhì)資源皂苷類型。