QuEChERS-UPLC-MS/MS-內(nèi)標法測定肉制餐飲食品中5種罌粟殼生物堿

周迎春 楊盛茹 華向美 李單單

摘 要：建立改進的QuEChERS（quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）方法，以內(nèi)標法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定肉制餐飲食品中嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因5 種罌粟殼生物堿。樣品經(jīng)乙腈-體積分數(shù)0.1%氨水提取，凈化包（2 g無水硫酸鎂、50 mg N-丙基乙二胺，100 mg C18E）凈化，選擇含10 mmol/L甲酸銨的體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液和體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相，采用等度洗脫，使凈化液中5 種罌粟殼生物堿經(jīng)HILIC Core-shell色譜柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，在多反應監(jiān)測模式下利用電噴霧電離源正離子模式掃描獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，內(nèi)標法定量。結(jié)果表明：5 種罌粟殼生物堿可在8 min內(nèi)有效分離，且罌粟堿、那可丁、蒂巴因在0.2～20.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，嗎啡、可待因在1.0～100.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，r均大于0.999，方法檢出限為0.3～2.5 ng/mL，定量限為1.0～7.5 ng/mL，5 種罌粟殼生物堿的平均回收率為85.8%～107.4%，相對標準偏差為0.5%～4.7%。該方法操作簡單、凈化效果好、檢測效率高，適用于餐飲肉制食品中5 種罌粟殼生物堿的快速檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜;QuEChERS;5 種罌粟殼生物堿;餐飲肉制食品

Abstract： An analytical method using a modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rugged， safe） extraction procedure combined with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） with an internal standard was developed for the determination of five poppy husk alkaloids in meat products used in the catering industry， including morphine， codeine， nocictin， papaverine and thibaine. Samples were extracted with acetonitrile-0.1% （V/V） aqueous ammonia solution and the extract was purified with a mixture of sorbents： 2 g of anhydrous magnesium sulfate， 50 mg of primary secondary amine （PSA）， and 100 mg of C18E. Complete separation of the poppy husk alkaloids was achieved on an ACQUITY UPLC? HILIC Core-shell chromatographic column （50.0 mm × 2.1 mm， 1.7 μm） using a mobile phase composed of 10 mmol/L ammonium formate and 0.1% formic acid in acetonitrile by gradient elution. Mass spectrometric data were acquired using an electrospray ionization （ESI） source in the positive ion mode with multi-reaction monitoring （MRM）. The analytes were quantified by an internal standard method. The results showed that the five poppy husk alkaloids could be separated effectively within eight minutes and good linearity were obtained for morphine and codeine in the range of 0.2–20.0 ng/mL and for the other amines in the range of?1.0–100.0 ng/mL （r > 0.999）. The limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） were in the range from 0.3 to 1.5 ng/mL and from 1.0 to 5.0 ng/mL， respectively. Satisfactory recoveries for spiked samples were obtained in the range of 85.8%–107.4% with relative standard deviation （RSD） lower than 4.7%. In summary， the method is easy to operate and has good purification effect and high detection efficiency. It can be applied to the rapid determination of the five poppy husk alkaloids in meat products used in the catering industry.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; QuEChERS; five poppy husk alkaloids; meat products used in the catering industry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-128

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）12-0031-07

引文格式：

周迎春， 楊盛茹， 華向美， 等. QuEChERS-UPLC-MS/MS-內(nèi)標法測定肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿[J]. 肉類研究， 2021， 35（12）： 31-37 . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-128.? ? http：//www.rlyj.net.cn

罌粟殼是罌粟采完鴉片后的干燥、成熟果殼[1]，它富含50多種生物堿[2]。嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因是罌粟殼中主要的生物堿成分，它們具有一定藥用價值[3]，同時又具有一定成癮性[4]，長期食用含有罌粟殼生物堿的食品，會導致發(fā)冷、出虛汗、乏力犯困、面黃肌瘦等癥狀[5]，嚴重時會出現(xiàn)味覺感知能力降低、注意力和記憶力衰退的現(xiàn)象[6]，損害機體神經(jīng)[7]、內(nèi)分泌及消化系統(tǒng)[8]，進而產(chǎn)生一系列病變，導致機體成癮及慢性中毒，甚至引起死亡[9]。

國家藥品監(jiān)督管理局、衛(wèi)生部以及公安部都明令禁止在食品中非法添加罌粟殼[10]，并針對其含有的5 種主要罌粟殼生物堿成分制定了相關的檢驗標準[11]。但是極少部分餐飲店制作的肉制餐飲食品中仍存在非法添加罌粟殼生物堿的現(xiàn)象[12]。

目前測定罌粟殼生物堿的方法尚無統(tǒng)一的國家標準。2018年4月，國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》的公告中指出[13]，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer，HPLC-MS/MS）法測定食品中的嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因。但與DB 31/2010—2012《食品安全地方標準 火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中檢測方法[14]相比較，前者前處理相對復雜，后者方法檢出限（limit of detection，LOD）相對較高。高志瑩等[15]采用UPLC-MS/MS法測定肉湯中5 種罌粟殼生物堿時需測定基質(zhì)曲線，操作復雜，工作量大。

QuEChERS法是一種先經(jīng)鹽析[16]再經(jīng)N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和C18分散固定相凈化[7]的簡單、快捷、高效的前處理方法;UPLC-MS/MS法利用特征離子碎片定量[18]，具有檢測速率快、靈敏度高、特異性強、準確性高的優(yōu)點，是國際領先的檢測技術[19];內(nèi)標法通過添加同位素內(nèi)標物質(zhì)可以有效補償樣品前處理的損失和離子化時的基質(zhì)效應[20-21]，從而大大提高檢測準確性，尤其適用于復雜基質(zhì)樣品的檢測[22]?？紤]到同位素內(nèi)標價格昂貴，因此本研究采用可待因-D3和嗎啡-D3作內(nèi)標進行定量，同時對QuEChERS法進行優(yōu)化改良，建立一種利用QuEChERS-UPLC-MS/MS法測定肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹵肉、羊肉湯、牛肉湯、骨湯膏等均購買于某商場。

凈化包（2 g無水硫酸鎂、50 mg PSA、100 mg C18E） 月旭科技（上海）股份有限公司;混合標準品溶液（嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為50 mg/L，那可丁、罌粟堿和蒂巴因質(zhì)量濃度為10 mg/L）、混合內(nèi)標溶液（內(nèi)標物嗎啡-D3、可待因-D3質(zhì)量濃度均為20 mg/L，-18 ℃避光保存） 上海安譜科技股份有限公司;所有實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

XEVO TQ UPLC-MS/MS 美國Waters公司;5810R型離心機 德國Eppendorf公司;KQ 5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;XPE 205型分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2.00 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入50 μL同位素內(nèi)標工作液（固體類樣品加2 mL水），振搖使樣品分散均勻，加入5 mL體積分數(shù)0.1%氨水-乙腈，渦旋振蕩5 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

在待凈化上清液中加入凈化包，渦旋混合30 s，以4 000 r/min離心5 min，移取上清液，用0.22 μm有機濾膜過濾，取適量濾液上機測定。

1.3.2 標準溶液與內(nèi)標溶液的配制

5 種罌粟殼生物堿混合標準儲備液：取混合標準品溶液1 mL于100 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因質(zhì)量濃度為100 ng/mL，嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為500 ng/mL的混合標準儲備液。4 ℃避光保存，有效期3 個月。

同位素內(nèi)標工作溶液：分別精密吸取混合內(nèi)標溶液適量，用乙腈配制成嗎啡-D3、可待因-D3質(zhì)量濃度均為5.0 mg/L的同位素內(nèi)標工作溶液。4 ℃避光保存，有效期3 個月。

混合標準工作溶液：分別精密吸取上述混合標準儲備液和同位素內(nèi)標工作溶液適量，用乙腈稀釋成罌粟堿、那可丁、蒂巴因質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，嗎啡、可待因質(zhì)量濃度梯度為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的系列混合標準工作溶液，嗎啡-D3、可待因-D3內(nèi)標溶液質(zhì)量濃度均為50.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 UPLC-MS/MS檢測條件

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC? HILIC Core-shell色譜柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ℃;流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液（含10 mmol/L甲酸銨），流動相B為體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液;等度洗脫，流動相A與流動相B體積比為1∶9;流速0.3 mL/min;進樣量5.0 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子多反應檢測模式采集，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔電壓30 V，毛細管電壓1.5 kV，嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因、嗎啡-D3及可待因-D3質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜采集及定性、定量分析均采用Mass Lynx V4.1軟件，采用Excel 2016軟件進行圖形繪制和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC條件優(yōu)化

由于肉制餐飲食品往往蛋白、脂肪含量高，基質(zhì)相對復雜，在霧滴表面離子化過程中，樣品基質(zhì)中的非揮發(fā)性組分與待測物質(zhì)非常容易產(chǎn)生競爭，影響電噴霧接口處的離子化效率，進而增強或抑制被分析物離子的形成效能，產(chǎn)生基質(zhì)增強或抑制效應，使檢測靈敏度和準確度下降[23]。因此，通過加入同位素內(nèi)標、稀釋或濃縮樣品、選擇合適的色譜柱、優(yōu)化流動相梯度洗脫程序等方法有效降低或消除基質(zhì)干擾及基質(zhì)效應。

考察ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC? BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC? HILIC Core-shell（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）3 種色譜柱對肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿分離效果的影響。

由圖1A～B可知，使用前2 種色譜柱均無法有效分離5 種罌粟殼生物堿，且峰型差、響應較低，難以定性定量，而使用HILIC Core-shell柱則能達到較好的分離效果（圖1C）。因此，選用HILIC Core-shell色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）進一步優(yōu)化HPLC流動相條件。

由于5 種罌粟殼生物堿易溶于甲醇或乙腈，實驗分別考察了甲醇和乙腈作為強洗脫流動相的洗脫效果。當乙腈?水體系作為流動相時，在正離子模式下的洗脫效果和響應強度均優(yōu)于甲醇?水體系，這有可能是因為待測物在甲醇中穩(wěn)定性較差。因此，實驗選擇乙腈作為流動相。同時，這5 種罌粟殼生物堿都含較多羥基[24]，采用在流動相中加入體積分數(shù)0.1%的甲酸以提高待測物在正離子模式下的離子化效率，容易得到[M+H]+離子，提高靈敏度。

當使用體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液和體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相進行等度洗脫時，待測物有嚴重的拖尾現(xiàn)象，峰型差。嘗試在體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液中加入一定的甲酸銨，發(fā)現(xiàn)可以有效改善峰拖尾、峰型差的問題。為了提高目標化合物的響應和定量精確度，進一步考察不同濃度甲酸銨對目標化合物離子化效率的影響。結(jié)果表明，在體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液中加入10 mmol/L甲酸銨能夠有效增強目標化合物的響應值并改善目標峰峰型，而繼續(xù)增加甲酸銨濃度反而降低了目標化合物的離子化效率。因此，實驗選擇含10 mmol/L甲酸銨的體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液和體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)5 種罌粟殼生物堿及2 種內(nèi)標物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)，實驗選擇正離子模式。通過質(zhì)譜模式，優(yōu)化毛細管電壓、脫溶劑氣流速及溫度等參數(shù)，使5 種罌粟殼生物堿及2 種同位素內(nèi)標物質(zhì)的母離子響應較高且穩(wěn)定;采用Intellistart模式優(yōu)化子離子的碰撞電壓和錐孔電壓，以獲得較高的響應，選擇離子豐度最高的子離子作為定量離子，離子豐度次高的子離子作為定性離子，各化合物的提取離子流色譜圖見圖2。

罌粟堿和蒂巴因與可待因分子結(jié)構(gòu)較為接近，為降低成本，對空白基質(zhì)樣品前處理定容后，取定容液加標上機檢測，通過相對誤差比較2 種定量方式對結(jié)果的影響：可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因用可待因-D3進行內(nèi)標法定量，嗎啡用嗎啡-D3進行內(nèi)標法定量（以下稱方法1）[25];罌粟堿、那可丁、蒂巴因用外標法定量，可待因用可待因-D3、嗎啡用嗎啡-D3進行內(nèi)標法定量（以下稱方法2）。

由表2可知，采用方法1時，那可丁、罌粟堿、蒂巴因定量結(jié)果的相對誤差顯著小于方法2，說明方法1可以有效降低基質(zhì)干擾，具有很好的校準效果，有利于提升定量準確性，從而提高目標物的回收率。因此，選取方法1進行定量分析。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取試劑的選擇

在試樣中加入適量水有助于提高提取效率，這是因為水能夠增強提取試劑的滲透能力，促進提取試劑滲透到基質(zhì)較為復雜的肉制餐飲食品中，從而提高回收率。選用乙腈、甲醇、乙酸乙酯為提取試劑，回收率由低到高依次為乙酸乙酯、甲醇、乙腈，這可能是由于提取試劑極性越大，肉制餐飲食品試樣中脂類等弱極性雜質(zhì)溶解越少，從而提高回收率。

為研究酸堿對于提取效率的影響，實驗對比不同體積分數(shù)的甲酸-乙腈溶液和氨水-乙腈溶液的回收率。由圖3～4可知：在那可丁、罌粟堿、蒂巴因加標水平為2.0 μg/kg，可待因、嗎啡加標水平為10.0 μg/kg時，隨著甲酸體積分數(shù)的增加，除罌粟堿回收率基本不變外，其余4 種罌粟殼生物堿的回收率均呈先升高后降低的趨勢，當提取液中甲酸體積分數(shù)為0.2%時，各目標化合物回收率最高;隨著氨水體積分數(shù)的增加，5 種罌粟殼生物堿提取效率均呈先升高后降低的趨勢，且均高于相同體積分數(shù)甲酸時各目標化合物的提取效率。這說明5 種罌粟殼生物堿在堿性條件下更易被提取。因此，選擇體積分數(shù)0.1%氨水-乙腈溶液作為提取試劑。

2.3.2 凈化方法的選擇

肉制餐飲食品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂和色素等物質(zhì)[26]，成分復雜，這些組分的存在會產(chǎn)生基質(zhì)效應，進而嚴重干擾目標化合物的測定，因此十分有必要對提取液進行凈化。有研究[27]指出提取液經(jīng)MCX柱吸附、洗脫后獲得的凈化效果較好。但是由于鹵肉、羊肉湯等肉制餐飲食品中組成成分相對復雜，通過固相小柱時容易造成堵塞，洗脫困難，導致目標物損失，不利于提高檢測效率。

PSA是一種極性吸附劑，同時含有伯胺和仲胺基團，具有弱陰離子交換能力，可有效去除脂類和糖類。C18可吸附提取液中的色素[28]，C18E是一種封尾的C18吸附劑填料，是疏水性最強的硅膠基吸附劑，其對非極性化合物具有出色的強吸附特性。因此，選用PSA和C18E作為凈化劑，去除雜質(zhì)干擾，同時加入適量無水硫酸鎂去除提取液中殘留的水分。移取2 mL待凈化上清液于定制的SPE凈化管（2 g無水硫酸鎂、50 mg PSA、100 mg C18E）中，渦旋30 s，4 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機相濾膜過濾，檢測結(jié)果表明雜質(zhì)峰明顯減少，并能獲得滿意的回收率。本實驗采用QuEChERS法，直接將固相分散吸附劑加入提取液中凈化，操作簡便、快捷、高效。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線線性、方法LOD及定量限（limit of quantitation，LOQ）可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因用可待因-D3進行內(nèi)標法定量，嗎啡用嗎啡-D3進行內(nèi)標法定量，以5 種罌粟殼生物堿與對應內(nèi)標響應峰面積之比為縱坐標，各目標物質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。分別以3 倍和10 倍信噪比（RS/N）確定5 種罌粟殼生物堿的方法LOD和LOQ。

由表3可知，5 種罌粟殼生物堿在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關系數(shù)均大于0.999，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[29]要求，能夠滿足肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿的快速檢測。

鹵肉、肉湯、骨湯膏3 種不同基質(zhì)樣品中5 種罌粟殼生物堿的方法LOD及LOQ如表4所示。由于骨湯膏中含有大量油脂和其他固形物，在一定程度上影響了檢測靈敏度，骨湯膏的方法LOD和LOQ均高于與其他2 種基質(zhì)樣品，但以上3 種基質(zhì)樣品中5 種罌粟殼生物堿的方法LOD及LOQ均低于吳義春等[30]采用QuEChERS-UPLC-MS法測定醬鹵肉中5 種罌粟殼生物堿的LOD和LOQ。

2.4.2 回收率及精密度

取陰性肉湯按1、2、10 倍LOQ 3 種水平加標，按照優(yōu)化條件前處理后測定，平行測定6 次，計算回收率以及相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）。由表5可知，5 種罌粟殼生物堿的平均回收率為85.5%～107.4%，RSD為0.5%～4.7%，符合GB/T 27404—2008要求，能夠滿足肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿的快速檢測。

2.5 實際樣品檢測

采用本實驗方法對50 批次的肉湯、鹵肉樣品進行檢測，每個樣品做2 個平行，同時與DB 31/2010—2012作對比，2 種方法檢出結(jié)果均為陰性，表明商場所售肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿檢出風險較低。

3 結(jié) 論

本研究通過篩選色譜柱、優(yōu)化提取溶劑、內(nèi)標法定量、QuEChERS法凈化等方法使目標物得以高效分離，建立了一種QuEChERS-UPLC-MS/MS法測定肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿的方法。該方法無需鹽析、操作簡便、高效快速，具有理想的回收率和精密度，很好地改進了檢測食品，尤其是脂肪、蛋白含量較高，食品中基質(zhì)效應大、靈敏度低等問題，嗎啡、可待因LOD為1.5～2.5 μg/kg，罌粟堿、那可丁、蒂巴因LOD為0.3～0.5 μg/kg，有效保證分析結(jié)果的重復性和重現(xiàn)性，適用范圍廣，能夠滿足多種肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿的檢測要求。實際樣品檢測結(jié)果表明，商場所售肉制餐飲食品中5 種罌粟殼生物堿檢出風險較低。

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