茶葉脫咖啡因技術(shù)的研究進(jìn)展

劉念，李搖搖，李霜

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)馬克思主義學(xué)院，湖北 武漢 430068）

茶是世界上最受歡迎的飲料之一，由茶樹的葉子和芽制成。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全國18個(gè)主要產(chǎn)茶省茶園面積306.52萬公頃，同比增加13.49萬公頃，增長率4.60%[1]。大約三分之二的世界人口每天飲用茶和相關(guān)產(chǎn)品，它在降低糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)和延緩疾病進(jìn)展方面發(fā)揮著積極作用[2]。茶葉中含有多種活性物質(zhì)，茶多酚和咖啡因是茶葉中最主要的兩大類活性物質(zhì)。茶多酚是具有高抗氧化性能的次生植物代謝產(chǎn)物，具有多種生理功效，如抗氧化[3]、抗癌[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]等；茶葉中咖啡因含量在 1%～5%，雖然咖啡因有緩解疲勞、刺激中樞神經(jīng)興奮、利尿等積極作用，但是攝入過量含有咖啡因的食品或者提取物，會(huì)存在睡眠障礙[7]、血壓升高[8]以及流產(chǎn)[9]等風(fēng)險(xiǎn)，所以，有關(guān)脫除茶葉中咖啡因的研究越來越受到人們的重視。

中國是世界主要茶葉生產(chǎn)國，茶葉出口涉及到了世界大多數(shù)國家[10]。2018年全國綠茶產(chǎn)量達(dá)到185萬噸左右。且綠茶屬于非年份茶，含有比紅茶和烏龍茶更高含量的兒茶素。此外，如果綠茶儲(chǔ)藏時(shí)間超過2 d～3 d，即使采用高溫復(fù)火的工藝，也很難恢復(fù)其品質(zhì)，從而會(huì)影響其商業(yè)價(jià)值[11]。為了避免綠茶茶葉的浪費(fèi)和充分利用資源，對(duì)綠茶的深加工刻不容緩，而對(duì)綠茶進(jìn)行深加工的核心問題在于綠茶中咖啡因與其他成分的分離。本文就近幾年茶葉中脫除咖啡因的方法和研究動(dòng)態(tài)進(jìn)行了概要綜述。

1 咖啡因的簡介

咖啡因是一種生物堿，存在于多種植物中，如茶葉、咖啡、可可豆、瓜拉那漿果和科拉果[12]?？Х瘸嗜鯄A性，白色粉末狀，難溶于水。在常溫下，咖啡因在氯仿中溶解度為18%，在水中的溶解度約為2%；然而，在100℃沸水中咖啡因的溶解度增加到70%[13]。一般來說，茶湯中咖啡因的含量會(huì)隨茶葉的種類、茶葉的量、開水的用量、沖泡溫度和沖泡時(shí)間的不同而變化[14-15]。目前，市場針對(duì)茶中咖啡因含量沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，美國規(guī)定咖啡因含量低于0.5%，而中國、日本規(guī)定咖啡因含量低于1%。

咖啡因有一些積極的生理作用，它與認(rèn)知功能的增強(qiáng)、神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)性的改善、情緒的改善和焦慮的緩解有關(guān)；但是過量攝入咖啡因會(huì)對(duì)一些人產(chǎn)生負(fù)面影響，如產(chǎn)生高血壓、焦慮、睡眠不足、心跳加速和流產(chǎn)[16]等不良的影響。此外，在某些情況下，攝入咖啡因會(huì)刺激胃腸道并導(dǎo)致失眠[17-18]。隨著人們生活水平的提高，由于咖啡因?qū)θ梭w存在的副作用導(dǎo)致茶葉在食品方面的應(yīng)用受到限制，所以茶葉脫咖啡因產(chǎn)品越來越受到人們的重視。

2 脫除咖啡因的方法

目前，茶葉中脫除咖啡因的方法有很多，如超臨界流體萃取法、離子沉淀法、水提法、乳酸乙酯加壓萃取法、樹脂吸附法、活性炭吸附法、蒙脫土吸附法、微生物降解法和生物降解法等。

2.1 化學(xué)溶劑脫除法

2.1.1 超臨界流體脫除法

超臨界流體萃取技術(shù)在分離咖啡因的研究中多次被應(yīng)用。超臨界流體是指物體的溫度和壓力超過臨界值的狀態(tài)。超臨界流體萃取技術(shù)的基本原理是利用超臨界流體特有的選擇性，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來，以達(dá)到分離和純化的目的。

Sun等[19]利用超臨界二氧化碳脫除綠茶中的咖啡因，為提高咖啡因在超臨界二氧化碳中的溶解度，增加了助溶劑乙醇，結(jié)果表明在70.2%的咖啡因被分離的同時(shí)只有6.2%的兒茶素被移除。但是水作為助溶劑時(shí)，78%的咖啡因被去除的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致67.6%的兒茶素被去除，表明該方法只適用于干茶葉脫咖啡因的研究，不適用于水溶液的體系。Tang等[20]進(jìn)行了超聲增強(qiáng)超臨界流體萃取技術(shù)去除綠茶中的咖啡因研究，該方法與Sun等[21]的方法的不同之處是增加了超聲技術(shù)，超聲空化產(chǎn)生的局部高溫高壓會(huì)破壞化學(xué)鍵，破壞或削弱基質(zhì)與溶質(zhì)的結(jié)合，提高了萃取速率，咖啡因的去除率為82.28%，超聲增強(qiáng)超臨界流體萃取技術(shù)為低咖啡因或去咖啡因茶的生產(chǎn)提供了新途徑。Lee等[22]研究了超臨界二氧化碳萃取技術(shù)去除綠茶中咖啡因時(shí)對(duì)綠茶揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)咖啡因去除得越多，揮發(fā)性成分就減少得越多，萜烯類化合物減少得最顯著，芳香型化合物也會(huì)有所減少，造成茶葉的風(fēng)味淡化，導(dǎo)致茶葉失去了飲用價(jià)值。Lee等[11]研究了超臨界二氧化碳脫除綠茶中咖啡因時(shí)對(duì)綠茶風(fēng)味和色澤的影響，發(fā)現(xiàn)在去除咖啡因的過程中芳樟醇等綠茶特征芳香成分減少，且破壞了葉綠素的固有結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致綠茶的綠色淡化，原因是超臨界二氧化碳呈酸性，在用超臨界CO2萃取時(shí)，葉綠素變成了脫鎂葉綠素[23]，所以綠色淡化，從而嚴(yán)重影響綠茶應(yīng)有的綠色外觀。綜上所述，超臨界流體萃取技術(shù)只適用于不含水的干茶葉，不適用于茶葉提取液，所以限制了其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.1.2 水脫除法

在熱水中，咖啡因能迅速分散溶解，而兒茶素類物質(zhì)由于分子量大于咖啡因，且溶解度低，比咖啡因浸出得速度慢，從而可以利用浸出速度和溶解度的不同來分離咖啡因[24]。

Liang等[25]研究了溫度、時(shí)間和茶水比等因素對(duì)熱水分離新鮮綠茶茶葉中咖啡因的影響。結(jié)果表明當(dāng)溫度從室溫（20℃）升到100℃時(shí)，茶湯中咖啡因的濃度從23.7mg/g下降到4.0mg/g，而兒茶素的濃度從134.5mg/g下降到127.6 mg/g，可以去除綠茶中83.12%的咖啡因，兒茶素的損失只有5.13%。新鮮茶葉經(jīng)殺青、揉捻、烘干后脫咖啡因，發(fā)現(xiàn)咖啡因含量降至1.2 mg/g～3.2 mg/g，但會(huì)減少16%～64%的兒茶素，所以水提法適用于新鮮葉子脫咖啡因，不適用于揉捻烘干后的葉子。Vuong等[26]利用此方法與噴霧干燥相結(jié)合制備低咖啡因的綠茶茶粉，結(jié)果表明可以去除綠茶中83%的咖啡因同時(shí)保留94%的兒茶素，低咖啡因茶粉中咖啡因含量為7 mg/g，可以為脫咖啡因綠茶茶粉提供理論依據(jù)，也可以應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)。但是這一方法存在局限性，如果紅茶的新鮮葉片采用熱水處理法脫去咖啡因，則會(huì)抑制發(fā)酵，因?yàn)楦邷貢?huì)使多酚氧化酶失活，從而使兒茶素不能被氧化成茶紅素，使紅茶色澤受到影響，所以水脫除法不適用于紅茶脫咖啡因的研究。且新鮮葉片經(jīng)短時(shí)的高溫?zé)崴幚?，?huì)使茶葉中易溶于水的物質(zhì)（氨基酸等）浸出，導(dǎo)致茶葉中其它成分質(zhì)量的降低，脫咖啡因的茶葉繼續(xù)加工成干茶葉，需蒸汽固定再搓卷烘干，會(huì)導(dǎo)致茶葉的風(fēng)味、顏色等其他營養(yǎng)成分的損失更大，所以熱水提取法不適合茶葉脫咖啡因。

2.1.3 乳酸乙酯脫除法

乳酸乙酯的結(jié)構(gòu)是2-羥基丙酸乙酯，由于其具有較高的溶解能力、可生物降解、無腐蝕性、無致癌性、無致畸性、無臭氧等特點(diǎn)[27]，使其應(yīng)用面很廣，例如，乳酸乙酯可以應(yīng)用于污染土壤的螯合劑[28-29]，用于制藥行業(yè)[30-31]，作為食品成分或者營養(yǎng)藥品的成分之一[32]等，因此工業(yè)上將它作為綠色溶劑使用越來越受到關(guān)注。在30℃時(shí)，咖啡因在乳酸乙酯中的溶解度為3.2%，這與咖啡因在水中的溶解度很相近[33]。Bermejo等[34]研究了乳酸乙酯對(duì)咖啡豆中咖啡因的萃取分離，得到咖啡因的回收率高達(dá)60%左右的結(jié)果。該方法與水提法的不同點(diǎn)在于是直接萃取，水提法需要先將原料浸泡在水中加熱，這個(gè)過程可能會(huì)導(dǎo)致基本的風(fēng)味和芳香物質(zhì)的損失。

Bermejo等[35]研究了乳酸乙酯與超臨界二氧化碳相結(jié)合對(duì)綠茶中咖啡因的影響，結(jié)果表明咖啡因的提取率為13 mg/g～14 mg/g，且萃取速度是超臨界二氧化碳的7倍左右，可以縮短提取時(shí)間，但會(huì)導(dǎo)致綠茶中揮發(fā)性成分散失以及綠色的淡化。Villanueva等[32]在咖啡豆脫咖啡因的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了茶葉中脫咖啡因的進(jìn)一步研究，主要選用水、乳酸乙酯、乳酸乙酯與水的混合物作為提取溶劑，進(jìn)行咖啡因的提取，發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯與水混合后提取效果更佳，結(jié)果表明在100℃時(shí)，咖啡因的脫除率為53%，咖啡因和兒茶素的回收率之比為2，而Park等[36]采用超臨界二氧化碳流體進(jìn)行綠茶中脫咖啡因的研究發(fā)現(xiàn)咖啡因與兒茶素回收率的比為1.5左右，對(duì)比得到乳酸乙酯與水混合后分離咖啡因的效果較好，但是當(dāng)溫度超過150℃時(shí)，咖啡因的脫除率為76%～92%，但是兒茶素卻有下降趨勢(shì)，說明高溫可以提高咖啡因的脫除率，同理，不利于兒茶素的溶解，降低了兒茶素的提取率。綜上所述，乳酸乙酯加壓萃取法脫除咖啡因時(shí)會(huì)導(dǎo)致綠茶中芳香物質(zhì)的損失，顏色的淡化以及兒茶素在高溫下的損失，所以需要進(jìn)一步優(yōu)化其脫除咖啡因的條件。

2.2 物理吸附法

2.2.1 樹脂吸附法

目前，關(guān)于樹脂吸附法分離咖啡因的研究很多，不同的樹脂吸附分離咖啡因的效果存在差異。極性的樹脂主要通過氫鍵鍵合實(shí)現(xiàn)分離，分離效果較好，而非極性的樹脂主要通過范德華力進(jìn)行分離，分離效果不如極性樹脂[37]。

王瑞芳等[38]用大孔樹脂研究茶水提取液中咖啡因的分離，發(fā)現(xiàn)咖啡因的相對(duì)百分含量由6.37%降至0.3%左右，而兒茶素類的回收率只有65.21%，兒茶素的損失較大。Li等[39]研究超濾聯(lián)合吸附樹脂法從綠茶提取液中分離茶多酚和咖啡因，其主要過程：水浸提法→超濾→PA樹脂吸附→洗脫。所得到的綠茶提取液中咖啡因含量小于4%，茶多酚含量高于90%，該方法與王瑞芳等[40]研究的不同點(diǎn)在于將醋酸纖維素鈦復(fù)合超濾膜與樹脂進(jìn)行了結(jié)合，提高了分離的效率，減少了茶多酚的損失。王瑞芳等[40]研究了樹脂吸附法脫綠茶中的咖啡因，結(jié)果表明RS-2樹脂可使綠茶茶湯中咖啡因的含量由10.08%降至0.18%左右，RS-1樹脂由于其極性較強(qiáng)會(huì)吸附溶液中的色素，導(dǎo)致茶湯的顏色明顯變淺，脫色率達(dá)74.96%，導(dǎo)致綠茶失去綠色，影響其外觀，故樹脂吸附法不適用于綠茶脫咖啡因。

2.2.2 活性炭吸附法

活性炭具有孔結(jié)構(gòu)、吸附能力強(qiáng)、比表面積大、可回收利用等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、電子、化工和國防等領(lǐng)域[41-42]?；钚蕴课椒ㄊ抢没钚蕴繉?duì)不同物質(zhì)選擇性吸附的原理[43]，從而實(shí)現(xiàn)不同的物質(zhì)的分離，咖啡因具有多羥基嘌呤環(huán)和共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，容易被活性炭這種多孔的物質(zhì)吸附分離[44]。

薛長暉等[44]在活性炭吸附咖啡因的研究中得到咖啡因的脫除率為69%左右。王平等[45]研究了時(shí)間、活性炭用量、溫度和樣品溶液濃度對(duì)脫除綠茶提取液中咖啡因的影響，結(jié)果表明茶多酚與咖啡因的質(zhì)量比由原來的6.9增至64.8，但該方法吸附時(shí)間不容易控制，超過一定的吸附時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致茶多酚的大量損失。黃繼軫等[46]研究了脫咖啡因的速溶綠茶，在活性炭表面，制備一層厚度適當(dāng)、具有疏水性、能夠選擇性地使咖啡堿通過的膜，結(jié)果表明咖啡因的脫除率達(dá)80%以上，速溶茶產(chǎn)品中咖啡因的含量在1%左右。但是不同制備膜的材料會(huì)在脫咖啡因時(shí)產(chǎn)生不良的影響，如三丁酸甘油酯會(huì)使茶的風(fēng)味變差等?；钚蕴烤哂忻撋奶攸c(diǎn)，會(huì)影響茶湯的色澤，此法不適用于脫除茶葉中的咖啡因。

2.2.3 蒙脫土吸附法

蒙脫土是一種層狀黏土礦物，具有膨脹、增厚、吸附和塑性等性能，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、土木工程、制藥、化妝品和食品等行業(yè)[47-49]。它由超薄結(jié)晶硅酸鹽組成，由水合夾層隔開，層間空隙中補(bǔ)償負(fù)電荷硅酸鹽層的陽離子很容易與各種有機(jī)陽離子交換。與較小尺寸的有機(jī)銨陽離子，如四甲基銨和三甲基苯基胺離子陽離子進(jìn)行交換反應(yīng)，形成被陽離子硅酸鹽層結(jié)構(gòu)包圍的納米空間[50]，從而能夠吸附咖啡因。

蒙脫土獨(dú)特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)也為茶湯的渾濁機(jī)理提供了進(jìn)一步的解釋，綠茶經(jīng)蒙脫土處理脫去咖啡因后會(huì)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，這是由于蒙脫土中間層釋放的鈣離子與綠茶中的草酸根離子反應(yīng)生成草酸鈣沉淀所致?？梢酝ㄟ^層間效應(yīng)，用離子法制備蒙脫土的中間離子，用Na、K、Mg或NH4離子取代蒙脫土層間的鈣離子[51]，從而可以抑制脫咖啡因綠茶中草酸鈣的析出，經(jīng)過離子交換的蒙脫土可以分離綠茶中的咖啡因，保持綠茶的外觀質(zhì)量。

Shiono等[51]以蒙脫土為原料，對(duì)茶葉提取物進(jìn)行了脫咖啡因的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒙脫土在吸附咖啡因時(shí)，對(duì)咖啡基奎寧酸等均無明顯吸附，而活性炭在同樣條件下吸附咖啡因的同時(shí)也吸附了咖啡基奎寧酸和咖啡基奎寧內(nèi)酯，由此可以表明蒙脫土對(duì)茶葉提取物中咖啡因的吸附效果優(yōu)于活性炭，且不影響其它物質(zhì)的質(zhì)量。Okada等[50]以天然鈉蒙脫土和合成鈉皂苷為主要材料進(jìn)行了脫咖啡因的研究，與Shiono等[51]研究的不同點(diǎn)在于利用芐胺鹽酸鹽對(duì)蒙脫土進(jìn)行了前處理。結(jié)果表明在低濃度的咖啡因中，經(jīng)處理得到的改性蒙脫土吸附咖啡因的效率高達(dá)96%以上，該試驗(yàn)也分析了水溶液中蒙脫土的納米結(jié)構(gòu)改性前后的變化，蒙脫土經(jīng)芐胺鹽酸鹽處理后減少了插入的陽離子數(shù)量，同時(shí)增加了硅氧烷與芐胺鹽酸鹽的作用從而增加了對(duì)咖啡因的吸附表面積，水分子的插入引發(fā)了對(duì)咖啡因吸附的協(xié)同作用，從而提高了對(duì)咖啡因的吸附，但是蒙脫土與咖啡因之間的作用機(jī)理需要進(jìn)一步證實(shí)。Yamamoto等[52]通過X射線衍射、漫反射紅外傅里葉光譜法轉(zhuǎn)換光譜學(xué)（漂移）和掃描探針顯微鏡探究了蒙脫土與咖啡因之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)咖啡因分子都被吸附到層間空間和表面，與Si-OH和硅氧烷之間發(fā)生相互作用。這一發(fā)現(xiàn)將有助于在生產(chǎn)咖啡飲料和食品時(shí)，選擇層間空間中的離子和有機(jī)化合物，以提高蒙脫土吸附咖啡因的量。

2.3 生物脫除法

2.3.1 微生物降解法

Kurtzman等[53]在1970年首次提出了微生物可以降解咖啡因。細(xì)菌的降解途徑主要是通過脫甲基化[54]，但真菌降解咖啡因的途徑尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

Ramarethinam等[55]研究了茶植物中的咖啡因的代謝機(jī)理，發(fā)現(xiàn)將地衣芽孢桿菌噴灑在茶樹上時(shí)，茶葉中咖啡因的含量明顯下降，且不影響其它茶葉成分的質(zhì)量與含量，此方法為低咖啡因茶樹的種植提供了理論依據(jù)。Gokulakrishna等[56]進(jìn)行了將咖啡因作為微生物培養(yǎng)基的唯一碳源和氮源的測試，發(fā)現(xiàn)假單胞菌GSC1182在48 h內(nèi)對(duì)咖啡因的降解率達(dá)到80%，當(dāng)有蔗糖存在時(shí)咖啡因的降解率提高，但在蔗糖沒有被消耗時(shí)，對(duì)咖啡因的降解也表現(xiàn)出了促進(jìn)作用，其促進(jìn)作用的機(jī)理尚不明晰，需要進(jìn)一步的研究。Babu等[57]利用分離的P.alcaligenes假單細(xì)胞菌CFR 1708細(xì)胞碎片進(jìn)行生物脫咖啡因的研究，結(jié)果表明含量為3%～7%的咖啡因的樣品需要80 h左右才能被降解完全。該方法的降解速率低，時(shí)間長，而且在脫咖啡因食品飲料等中的應(yīng)用需要進(jìn)一步研究。

2.3.2 酶降解法

咖啡因是由黃嘌呤合成的，因此可以通過抑制能促使黃嘌呤合成的酶活性而停止植物中咖啡因的合成[54]，從而減少咖啡因的含量，達(dá)到脫除咖啡因的效果。

Ogita等[58]利用RNA干擾技術(shù)抑制咖啡植株中的可可堿合酶和咖啡因合酶基因，使植株的咖啡因含量降低50%，此方法可用來種植含低咖啡因茶葉的茶樹。周斌星[59]研究了普洱茶發(fā)酵分離出兩種優(yōu)勢(shì)菌種黑曲霉NCBT 110A和聚多曲霉NRRL 250，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)缺失時(shí)，sydowii曲霉NRRL 250可以利用咖啡因作為碳源，從而降解82.09%的咖啡因。此方法克服了Babu等研究方法的局限性，可以應(yīng)用于生產(chǎn)不含咖啡因的茶。在生物中降解咖啡因的酶主要是去甲基酶，Yamoka等[60]進(jìn)行了去甲基酶的純化，發(fā)現(xiàn)純化后這種酶很不穩(wěn)定，很容易失活。因此，目前該方法不適用脫咖啡因的研究，需要進(jìn)一步探究去甲基酶穩(wěn)定的條件，為茶葉中脫咖啡因的研究提供理論依據(jù)。

3 總結(jié)和展望

本文綜述了水提法、超臨界流體萃取法、乳酸乙酯加壓萃取法、活性炭吸附法、樹脂吸附法、蒙脫土吸附法、微生物降解法以及酶降解法來脫除茶葉中咖啡因的研究進(jìn)展及優(yōu)缺點(diǎn)，這些方法均能達(dá)到脫除咖啡因的效果，但是一些方法會(huì)影響茶葉中其它成分的質(zhì)量，如揮發(fā)性成分的散失、綠色的淡化以及茶多酚的損失等，需要進(jìn)一步優(yōu)化條件進(jìn)行脫咖啡因的研究。此外，通過對(duì)比目前脫除咖啡因的方法，得到蒙脫土能較高效率的脫除茶葉中的咖啡因，且不影響茶葉中的其它成分。但是蒙脫土在脫除咖啡因的產(chǎn)品和茶飲料中應(yīng)用較少，這是今后研究的一個(gè)方向。同時(shí)，在進(jìn)行改性蒙脫土脫咖啡因的研究時(shí)，由于咖啡因呈弱堿性，所以pH值對(duì)脫除咖啡因有一定的影響，可以通過調(diào)節(jié)pH值來進(jìn)一步優(yōu)化改性蒙脫土的條件來進(jìn)行咖啡因的脫除。不同的溫度、時(shí)間、茶葉與水的比例對(duì)咖啡因脫除的效果也有不同程度的影響。本文為改性蒙脫土進(jìn)一步脫除茶葉中咖啡因的研究提供了理論依據(jù)和方法。