56 ℃ 30 min滅活對(duì)新型冠狀病毒抗體和生化免疫檢測(cè)結(jié)果的影響

郭旺源，湯 敏，史文元，譚 潭，魯 爽，胡 政，賀榮章，李 佳，羅迪賢，彭旭紅△

1.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000；2.湖南省郴州市第二人民醫(yī)院，湖南郴州 423000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染力強(qiáng)，人群普遍易感，其引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)目前尚無(wú)針對(duì)特異性治療藥物。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將COVID-19納入乙類傳染病，并按甲類傳染病進(jìn)行預(yù)防和控制。由于COVID-19患者血液標(biāo)本有大的傳染性，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員存在職業(yè)暴露可能，給實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員帶來(lái)極大的心理壓力[1]?！缎滦凸跔畈《痉窝追揽胤桨?第五版)》指出SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min處理可被滅活[2]。本研究將探討56 ℃ 30 min滅活處理對(duì)SARS-CoV-2 IgM抗體和生化免疫檢測(cè)結(jié)果的影響，為降低實(shí)驗(yàn)室傳播風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員安全提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年2月11-18日在郴州市第一人民醫(yī)院和郴州市第二人民醫(yī)院住院的SARS-CoV-2感染者或疑似感染者血液標(biāo)本54例，其中男34例、女20例，年齡2～74歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：COVID-19診斷依據(jù)為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)[3]，確診病例具備SARS-CoV-2病原學(xué)證據(jù)。本項(xiàng)研究通過(guò)郴州市第一人民醫(yī)院和郴州市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或家屬均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2 IgM抗體檢測(cè)采用北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的膠體金快速檢測(cè)專用試劑；術(shù)前八項(xiàng)檢測(cè)使用蘇州新波全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀(檢測(cè)儀器型號(hào)：EasyCuta MiNi)及廠家配套試劑，陰性和弱陽(yáng)性質(zhì)控使用北京康徹斯坦生產(chǎn)的第三方質(zhì)控品；生化項(xiàng)目檢測(cè)采用西門(mén)子AVDIA 2400全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)，高、中、低3個(gè)水平質(zhì)控采用美國(guó)伯樂(lè)生產(chǎn)的第三方質(zhì)控品；滅活采用江蘇榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)的可調(diào)式恒溫水浴箱，型號(hào)為HH-W420。核酸提取試劑(圣湘生物定制)、SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(圣湘生物)、ABI7500熒光定量PCR儀(Thermofisher公司)用于SARS-CoV-2感染者的確診。

1.3方法 使用力因精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)品(上海)有限公司的負(fù)壓真空分離膠采血管(黃帽管)同時(shí)采集血液標(biāo)本兩管，各5 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，其中一管按《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第五版)》等相關(guān)防護(hù)規(guī)范要求進(jìn)行未滅活前的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)[2]，另一管離心后不揭蓋放置于56 ℃恒溫水浴箱溫育30 min滅活處理，再進(jìn)行相同指標(biāo)檢測(cè)。所有標(biāo)本檢測(cè)嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，當(dāng)日當(dāng)批次室內(nèi)質(zhì)控在控。SARS-CoV-2 IgM抗體按定性結(jié)果報(bào)告，術(shù)前八項(xiàng)[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)、乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)、丙型肝炎病毒抗體(HCV-Ab)、艾滋病病毒抗體(HIV-Ab)和梅毒抗體(TP-Ab)]、電解質(zhì)、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶結(jié)果按定量結(jié)果報(bào)告。結(jié)果分為未滅活組和滅活后組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(P25～P75)表示，組間比較采用自身配對(duì)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn))。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1滅活處理前后血清SARS-CoV-2 IgM抗體結(jié)果 54例患者中，經(jīng)咽拭子核酸檢測(cè)陽(yáng)性并經(jīng)臨床確診的病例有20例，對(duì)54例患者血液標(biāo)本56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清SARS-CoV-2 IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示54例患者血標(biāo)本中，滅活前檢出陽(yáng)性26例，陰性28例，滅活后僅3例陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)為了弱陽(yáng)性，滅活前后血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢測(cè)結(jié)果完全一致性達(dá)94.4%(51/54)。

2.2滅活處理前后術(shù)前八項(xiàng)結(jié)果 對(duì)患者血液標(biāo)本56 ℃ 30 min滅活處理前后采用時(shí)間分辨免疫熒光法進(jìn)行血清術(shù)前八項(xiàng)(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HCV-Ab、HIV-Ab和TP-Ab)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)術(shù)前八項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果在滅活處理前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 滅活處理前后術(shù)前八項(xiàng)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

組別HBcAb(PEI U/mL)HCV-Ab(S/CO)HIV-Ab(S/CO)TP-Ab(S/CO)未滅活組7.710(0.659～9.120)0.232(0.225～0.246)0.157(0.146～0.166)0.064(0.052～0.069)滅活后組7.235(0.680～8.094)0.237(0.226～0.252)0.152(0.135～0.171)0.060(0.054～0.066)Z-1.381-1.008-0.406-0.049P0.1670.3130.6850.961

2.3滅活處理前后血清常規(guī)生化結(jié)果 對(duì)54例患者血液標(biāo)本56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)生化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)滅活處理前后電解質(zhì)、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶檢測(cè)結(jié)果中，肝功能中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)項(xiàng)目結(jié)果在滅活處理前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，心肌酶檢測(cè)中的肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌紅蛋白(Mb)水平在滅活處理前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余項(xiàng)目未發(fā)現(xiàn)滅活處理前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2～6。

表2 滅活處理前后血清電解質(zhì)檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

表3 滅活處理前后血清肝功能檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

組別天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)膽汁酸(μmol/L)ALP(U/L)GGT(U/L)未滅活組29.30(20.98～43.65)3.00(1.80～11.90)80.80(61.65～99.60)66.45(35.80～181.50)滅活后組23.60(19.68～36.83)2.70(1.60～12.40)0.05(0.00～1.47)37.90(15.30～77.80)Z-1.813-0.194-6.321-3.308P0.070.846<0.0010.001

表4 滅活處理前后血清腎功能檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

表5 滅活處理前后血清血糖和血脂檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

表6 滅活處理前后血清常規(guī)心肌酶檢測(cè)結(jié)果比較[M(P25～P75)]

3 討 論

對(duì)COVID-19最有效的防控手段就是早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早隔離，早治療[4-5]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第六版)》(以下簡(jiǎn)稱方案)指出經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是該病毒主要的傳播途徑。在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[3]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝讓?shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第四版)》要求，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)、生化分析等操作，應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作，但個(gè)人防護(hù)裝備參照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的防護(hù)要求[2]。目前所見(jiàn)傳染源主要是SARS-CoV-2感染的患者，無(wú)癥狀感染者也可能成為傳染源。所以臨床實(shí)驗(yàn)室人員在未經(jīng)檢測(cè)前無(wú)法預(yù)知該標(biāo)本是否具有潛在傳染性，檢測(cè)過(guò)程勢(shì)必造成嚴(yán)重的心理壓力[1,6]。

同時(shí)方案中指出：“對(duì)冠狀病毒理化特性的認(rèn)識(shí)多來(lái)自對(duì)SARS-CoV 和MERS-CoV的研究。病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒。”可見(jiàn)SARS-CoV-2對(duì)各種脂溶劑類消毒劑敏感，但因乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑消毒劑對(duì)各種檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測(cè)均有一定的影響而很少被采用[7]；紫外線常用于空氣和物體表面的消毒，對(duì)容器內(nèi)的血液標(biāo)本因穿透性和消毒效果有限，也限制了其使用[8]。本研究結(jié)合該病毒的理化特性和對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室存在的潛在傳染風(fēng)險(xiǎn)情況，對(duì)血液標(biāo)本在常規(guī)檢測(cè)前先將其離心分離后在未開(kāi)蓋情況下放置56 ℃環(huán)境溫育30 min進(jìn)行病毒滅活處理，達(dá)到降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)目的，比較滅活處理前后常見(jiàn)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果。

研究中選取的54例研究對(duì)象中，經(jīng)咽拭子核酸檢測(cè)陽(yáng)性并經(jīng)臨床確診的病例有20例，對(duì)54例患者的血液標(biāo)本經(jīng)56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清SARS-CoV-2 IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果54例患者血標(biāo)本中，滅活前檢出陽(yáng)性26例，陰性28例，滅活后僅3例陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)為了弱陽(yáng)性，滅活前后血清SARS-CoV-2 IgM結(jié)果完全一致性達(dá)94.4%(51/54)。術(shù)前八項(xiàng)檢測(cè)在滅活前后結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在滅活處理前后電解質(zhì)、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶等生化結(jié)果的比較中發(fā)現(xiàn)，ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH和Mb在血清病毒滅活后的檢驗(yàn)結(jié)果明顯低于滅活前，滅活處理前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這可能是ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb屬于不耐熱酶類，在加熱至56 ℃、30 min滅活處理過(guò)程中使其部分失去了酶活性而致檢測(cè)結(jié)果明顯降低[9-11]。故ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb等不耐熱酶類的項(xiàng)目檢驗(yàn)不適用于檢測(cè)前血清56 ℃ 30 min滅活處理。

綜上所述，對(duì)SARS-CoV-2感染者或疑似感染者血液標(biāo)本在常規(guī)檢測(cè)前可先將離心分離后的標(biāo)本在未開(kāi)蓋情況下放置56 ℃環(huán)境30 min進(jìn)行病毒滅活處理，對(duì)SARS-CoV-2 IgM抗體、術(shù)前八項(xiàng)等免疫感染類抗原抗體和多數(shù)生化常規(guī)檢測(cè)結(jié)果不會(huì)有太大影響，但該方法不能用于ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb等不耐熱酶類項(xiàng)目的檢測(cè)前處理。56 ℃ 30 min病毒滅活法不需要昂貴的設(shè)備，使用實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的可調(diào)式恒溫水浴箱，操作簡(jiǎn)單、易行，可考慮作為COVID-19疫情期間臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員預(yù)防職業(yè)暴露的一種切實(shí)可行的標(biāo)本前處理方法，從而可有效降低醫(yī)源性感染SARS-CoV-2風(fēng)險(xiǎn)和實(shí)驗(yàn)室工作人員的心理壓力及恐懼感。此研究為降低實(shí)驗(yàn)室傳播風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員安全提供數(shù)據(jù)參考。