透明質(zhì)酸微生物生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，最先由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的Karl Meyer等人于1934年從牛眼玻璃體中提取分離得到，為N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸通過β-1，4和β-1，3糖苷鍵反復(fù)交替連接而成的高分子聚合物，被認(rèn)為是唯一幾乎存在于從細(xì)菌到人類及所有動(dòng)物體之中的黏多糖。HA因其高度的黏彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性，在醫(yī)藥、化妝品、食品領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法是目前HA產(chǎn)品的主要生產(chǎn)方法。

近年來，研究者針對(duì)HA發(fā)酵菌株合成效率低、發(fā)酵產(chǎn)率低、產(chǎn)能小等生物合成問題，通過菌種誘變選育、基因編輯、代謝工程改造、代謝組學(xué)分析、發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面的深入研究建立了HA高效生物制備技術(shù)。如吳祥坤（2016）等從菌種的選育、發(fā)酵過程優(yōu)化和分離提取工藝條件入手獲得中等相對(duì)分子質(zhì)量HA。其以實(shí)驗(yàn)室保藏的獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus SL-2)為出發(fā)菌，利用等離子體誘變系統(tǒng)，篩選獲得一株產(chǎn)中等相對(duì)分子質(zhì)量HA的優(yōu)良菌株XKW-104。湯棟（2015）等以馬疫鏈球菌MF003為出發(fā)菌，通過H2O2氧化脅迫培養(yǎng)、紫外輻照(UV)和硫酸二乙酯(DES)對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得一株高產(chǎn)、高相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸酶缺陷菌株ZD-25。經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),該菌株透明質(zhì)酸產(chǎn)量（質(zhì)量濃度）達(dá)到1.61 g/L,相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到2.13×106,分別比原始菌株提高了120.5%和57.8%。經(jīng)5 L發(fā)酵罐初步發(fā)酵，突變株ZD-25的透明質(zhì)酸產(chǎn)量（質(zhì)量濃度）達(dá)到4.26 g/L,相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到2.90×106，分別比原始菌株提高了166.3%和93.3%。Sheng（2015）等用乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)的NICE系統(tǒng)構(gòu)建HA合成操縱子，在乳酸菌Lactococcus lactis中打通了HA合成路徑。中國(guó)專利CN201280048001.2涉及登錄號(hào)為KCTC 11818BP的停乳鏈球菌ID9103菌株和包含對(duì)所述菌株進(jìn)行培養(yǎng)的步驟的透明質(zhì)酸生產(chǎn)方法，該發(fā)明的菌株能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)高附加值的超高相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸，并且根據(jù)培養(yǎng)基的組成能夠生產(chǎn)各種超高相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸，以及生產(chǎn)最高具有10 000 000以上的平均相對(duì)分子質(zhì)量的超高相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸。CN201710485218.4公開了一種馬鏈球菌獸疫亞種SXY36及在發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸中的應(yīng)用，該SXY36經(jīng)紫外線、微波和γ射線照射誘變選育，無溶血性，HA發(fā)酵產(chǎn)率高，遺傳穩(wěn)定，在優(yōu)選的發(fā)酵條件下，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)率（質(zhì)量濃度）可達(dá)0.731 g/L，發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)率（質(zhì)量濃度）可達(dá)4.78 g/L；采用兩段變溫發(fā)酵和穩(wěn)定pH法，可以發(fā)酵制備高相對(duì)分子質(zhì)量HA，相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)1.89×106；采用發(fā)酵液自酶降解法制備不同相對(duì)分子質(zhì)量HA，控制酶解時(shí)間，即可生產(chǎn)相對(duì)分子質(zhì)量在3.5×104～1.89×106的HA。CN201310597818.1公開了一種高效重組表達(dá)透明質(zhì)酸酶的方法，其通過在重組透明質(zhì)酸酶基因N端添加一段編碼組氨酸的核苷酸序列，不僅簡(jiǎn)化了透明質(zhì)酸酶的純化步驟，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了重組透明質(zhì)酸酶的高活性分泌表達(dá)，活性達(dá)到了21 333.33 U/mL。CN202011150607.X公開了一種透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法，步驟如下：將馬疫鏈球菌活化培養(yǎng)；將活化后的馬疫鏈球菌接種到種子培養(yǎng)基中，在35～40℃、200～300 r/min條件下培養(yǎng)8～14 h；將副干酪乳桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，在36～38℃的條件下培養(yǎng)12～24 h；將馬疫鏈球菌種子液和副干酪乳桿菌種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在30～33℃，150～250 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)8～10 h，再在35～38℃，300～500 r/min條件下繼續(xù)發(fā)酵9～12 h，得到含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液。其將馬疫鏈球菌和副干酪乳桿菌進(jìn)行共同發(fā)酵，副干酪乳桿菌可以抑制發(fā)酵體系中透明質(zhì)酸酶的活性，保證了發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的活性和產(chǎn)量。CN201410467077.X公開了一種產(chǎn)透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法，采用獸疫鏈球菌來源的透明質(zhì)酸合酶hasA和枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD，分別置于組成型啟動(dòng)子GAP和TEF1下表達(dá)，在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。

綜合運(yùn)用基因工程和代謝工程學(xué)等方法，進(jìn)一步開展異源宿主生產(chǎn)HA的研究，建立一套高效、穩(wěn)定且安全的微生物發(fā)酵方案來獲得符合人們不同需求的特定相對(duì)分子質(zhì)量HA；構(gòu)建HA高效交聯(lián)、乙?；?、巰基化等精準(zhǔn)結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)HA全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)品研制，將是未來行業(yè)人員的研究重點(diǎn)。