免疫耐受在牛乳過敏中的研究進展

李 欣，程劍鋒，文學(xué)方，馬 鑫，陳紅兵

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學(xué)，江西 南昌330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌330047；3.江西省科學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌330096；4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌330047）

發(fā)達國家中約5%～15%的嬰兒可能會發(fā)生牛乳過敏，但根據(jù)嚴(yán)格的診斷標(biāo)準(zhǔn)，嬰兒期確診的牛乳過敏發(fā)病率只有2%～3%[1-2]。牛乳過敏是兒童早期最常見的食物蛋白過敏癥，據(jù)統(tǒng)計，出生后第一年發(fā)病率約為2%至3%，而花生、大豆、雞蛋小麥的過敏率分別為0.8%、0.8%、0.6%和0.2%[3]。牛乳過敏的概率在出生后第一年達到峰值，并且隨年齡增長慢慢消退[4-8]。在過去幾十年中，兒童期哮喘和鼻結(jié)膜炎等過敏性疾病發(fā)病率增加[9]，總體而言，牛乳的過敏率與其他食物的過敏率都呈增長的趨勢[10-11]。

大多數(shù)患有牛乳過敏的嬰兒會在出生后一個月內(nèi)、食用牛乳配方奶粉后一周內(nèi)出現(xiàn)。大多數(shù)患者同時有兩種癥狀：其中50%～70%有皮膚癥狀，50%～60%有胃腸道癥狀，20%～30%有呼吸道癥狀。在純母乳喂養(yǎng)的牛乳過敏患兒中，嚴(yán)重特應(yīng)性濕疹是主要癥狀[12-13]。

1 牛乳過敏的機理

牛乳過敏是由一種或多種乳蛋白引起的有害機體健康的免疫學(xué)反應(yīng)[14]。牛乳過敏反應(yīng)可包括3種免疫學(xué)機制：一是乳蛋白特異性IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)；二是非IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)（細胞毒性超敏反應(yīng)和遲發(fā)性超敏反應(yīng)）；三是IgE與非IgE介導(dǎo)的混合型過敏反應(yīng)，其中牛乳過敏反應(yīng)主要以乳蛋白特異性IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)為主[14-15]。

IgE介導(dǎo)的牛乳過敏的發(fā)展分兩個階段發(fā)生。首先是“致敏”：免疫系統(tǒng)首次接觸乳蛋白并產(chǎn)生針對乳蛋白的IgE抗體，這些抗體附著在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面，使機體處于致敏狀態(tài)。之后是“激發(fā)”；細胞相關(guān)的IgE結(jié)合乳蛋白上的過敏原表位，并引發(fā)強力炎癥介質(zhì)快速釋放，導(dǎo)致過敏癥狀發(fā)生[14]。

非IgE介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)主要包括以下3種類型：由IgG或IgM介導(dǎo)，補體、吞噬細胞和自然殺傷細胞引起細胞溶解和組織損傷的II型超敏反應(yīng)；由IgG介導(dǎo)，補體和血小板、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞引起充血水腫、血管炎性反應(yīng)和組織損傷的III型超敏反應(yīng)；由T細胞介導(dǎo)，單核/巨噬細胞和淋巴引起的炎癥和組織損傷的IV型超敏反應(yīng)[16-18]。IgE和非IgE介導(dǎo)的反應(yīng)并不相互排斥，對牛乳的反應(yīng)可能涉及免疫機制的混合[19]。

IgE介導(dǎo)的反應(yīng)常見于嬰兒期，非IgE介導(dǎo)的反應(yīng)在成人中占主導(dǎo)地位。據(jù)報道，非IgE介導(dǎo)的牛乳過敏（與IgE介導(dǎo)的牛乳過敏相比）在兒童時期產(chǎn)生耐受的概率較高[20-22]。這表明非IgE介導(dǎo)的牛乳過敏群體在成年階段出現(xiàn)概率比較高。

2 免疫耐受及相關(guān)的免疫細胞

食物免疫耐受是指機體免疫系統(tǒng)接觸某種食物抗原后對該抗原的特異性免疫無應(yīng)答，從而對該抗原不產(chǎn)生特異性免疫效應(yīng)細胞及特異性抗體[23-24]。若食物過敏原采用特殊方式攝入，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)耐受，則治療和預(yù)防免疫系統(tǒng)失調(diào)的過敏和其他非過敏性疾?。ㄈ缱陨砻庖吆推鞴僖浦玻┚哂锌尚行訹25]。免疫耐受主要受3種細胞調(diào)節(jié)：樹突狀細胞（DC）、調(diào)節(jié)性B（Breg）細胞、調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞。

2.1 樹突狀細胞

在腸系膜淋巴結(jié)（MLN）中，來自固有層的遷移CD103+DC可通過多種機制促進腸道歸巢Treg細胞的發(fā)育，進而產(chǎn)生耐受。CD103+DC產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和視黃酸（來自維生素A），驅(qū)動Treg細胞分化[26]。CD103+DC的整合素分子avb8上調(diào)能刺激產(chǎn)生TGF-β，且能誘導(dǎo)小鼠在對腸抗原產(chǎn)生耐受的過程中產(chǎn)生Treg細胞[27-28]。另外，CD103+DC可以表達吲哚胺2，3-雙加氧酶，這是一種參與色氨酸分解代謝的酶。若抑制吲哚胺2，3-雙加氧酶，會導(dǎo)致CD4+Foxp3+T調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)化減少和T細胞增殖，有利于誘導(dǎo)Th1和Th17轉(zhuǎn)化[29]，抑制耐受性產(chǎn)生。DC上的CD11b通過抑制幼稚T細胞向Th17細胞分化而促進口服耐受[30]。沒有炎癥信號，用抗原刺激脾CD11c+DC活化也會導(dǎo)致CD4+CD25+Treg細胞擴增，并誘導(dǎo)對確定抗原的耐受性[31]。

腸相關(guān)淋巴組織的DC產(chǎn)生視黃酸，與IL-6或IL-5協(xié)同作用，誘導(dǎo)IgA分泌；缺乏維生素A和視黃酸的小鼠，其小腸中缺乏IgA分泌細胞[32]。這些研究表明，來自DC和MLN間質(zhì)細胞的視黃酸對誘導(dǎo)B細胞和T細胞中的耐受性反應(yīng)非常重要。

2.2 調(diào)節(jié)性B細胞

通常認為：漿細胞通過產(chǎn)生抗原特異性抗體作用于免疫應(yīng)答，且有助于誘導(dǎo)CD4+T細胞活化[33]。Breg細胞通過產(chǎn)生抑制細胞因子（IL-10、TGF-β和IL-35）抑制效應(yīng)T細胞，從而在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[34]。

Breg細胞主要通過IL-10調(diào)節(jié)過敏性炎癥和耐受的免疫反應(yīng)[35]。產(chǎn)生IL-10的CD5+Breg細胞在腸系膜淋巴結(jié)中發(fā)揮作用，特別是在牛乳過敏原激發(fā)的小鼠模型中調(diào)節(jié)IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)[36]。CD9+B細胞通過IL-10抑制Th2和Th17的炎癥，使氣道炎癥減弱、肺功能正?；?，從而使哮喘模型小鼠的肺組織恢復(fù)良好的免疫平衡[37]。IL-4下調(diào)和IL-10上調(diào)會導(dǎo)致IgG4水平增加和IgE水平降低，其中IL-10可促進重鏈免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換為IgG4，IL-4則誘導(dǎo)重鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)換為IgE[38]。通過檢測IL-10過表達的B細胞，可發(fā)現(xiàn)B細胞誘導(dǎo)耐受的基本機制：B細胞可抑制樹突細胞成熟、T效應(yīng)細胞增殖和IgE產(chǎn)生，從而抑制過敏反應(yīng)發(fā)生。此外，過表達IL-10的B細胞會產(chǎn)生抗炎IL-1受體拮抗劑和血管內(nèi)皮生長因子，抑制促炎細胞因子產(chǎn)生[39]。

TGF-β是一種多效細胞因子，有促進傷口愈合、組織重塑及免疫調(diào)節(jié)等功能。更重要的是，它參與幼稚CD4+T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細胞的過程[40]。IL-35通過誘導(dǎo)Treg細胞增殖并抑制TH17反應(yīng)在免疫抑制中起作用[41]。

此外，1型Breg（Br1）細胞轉(zhuǎn)換為漿細胞時產(chǎn)生IgG4，IgG4是一種非炎癥性免疫球蛋白同種型，可阻止IgE介導(dǎo)的肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒[42]。過敏原特異性IgG4可能參與促進免疫耐受。Santos等[43]研究表明：與花生過敏患者相比，產(chǎn)生耐受的患者花生特異性IgG4與花生特異性IgE的比例更高。

2.3 調(diào)節(jié)性T細胞

Treg細胞在抑制Th2介導(dǎo)的炎癥和維持免疫耐受中必不可少[44]。CD4+Treg細胞分為兩類：天然型Treg（nTreg）細胞和誘導(dǎo)型Treg（iTreg）細胞。 在胸腺中T細胞成熟的正常過程中，CD4+Treg細胞分化成CD4+CD25+nTreg細胞；在特定刺激條件下，CD4+T細胞被激活產(chǎn)生CD4+iTreg細胞。iTreg有三種不同的亞組，（1）誘導(dǎo)性Foxp3+Treg細胞；（2）1型Treg（Tr1）細胞；（3）Th3細胞[45]。

Treg細胞能通過幾種抑制機制控制食物過敏反應(yīng)的致敏和效應(yīng)階段。Treg細胞可分泌抑制性細胞因子，如產(chǎn)生IL-10和TGF-β、抑制IL-2產(chǎn)生、下調(diào)抗原呈遞細胞（APC）[46]。Treg細胞還通過對肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的作用來抑制過敏性炎癥，在OX40-OX40配體的相互作用下通過細胞-細胞接觸抑制FceRI依賴性肥大細胞脫顆粒[47]。DC細胞是Treg細胞介導(dǎo)的免疫耐受的靶標(biāo)。DC細胞分泌CTLA-4（細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白）和LFA-1（淋巴細胞功能相關(guān)分子），Treg細胞（除了CD4+幼稚T細胞）優(yōu)先聚集在這些DC周圍并且下調(diào)DC上的CD80/86的表達。Treg細胞可抑制DC成熟和幼稚T細胞活化[48]。

CD4+CD25hiCD127lo/-nTreg細胞在健康個體中通過IL-10誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DC，而在哮喘患者中，nTreg細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DC的效率低得多，這導(dǎo)致哮喘嚴(yán)重程度增加[49]。在哮喘的實驗?zāi)Ｐ椭?，缺乏nTreg細胞導(dǎo)致DC介導(dǎo)的氣道炎癥增強[50]。

Foxp3敲除小鼠發(fā)生了與過敏性炎癥相關(guān)的多器官炎癥反應(yīng)[51-52]。過繼轉(zhuǎn)移Treg細胞能抑制小鼠食物過敏模型中的過敏反應(yīng)，并能控制Th2免疫反應(yīng)[53-54]。與健康對照相比，IgE介導(dǎo)的食物過敏兒童的Foxp3表達顯著降低[55-56]。

與Foxp3+iTreg不同，Tr1和Th3細胞不表達主調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。Tr1細胞的特點是：共表達CD49b和LAG-3表面標(biāo)志物，并分泌高水平的IL-10[57]。而Th3細胞不表達Foxp3或CD25，但在其表面表達潛伏激活肽（LAP），且LAP能產(chǎn)生抑制性細胞因子TGF-β。在小鼠中用卵白蛋白誘導(dǎo)Th3細胞進行表皮免疫治療，通過抑制TGF-β的產(chǎn)生進而抑制肥大細胞活化，以此預(yù)防過敏反應(yīng)[58]。在牛乳過敏的口服耐受模型中，低聚果糖可誘導(dǎo)Th3細胞抑制過敏反應(yīng)[59]。此外，Th3細胞能促進iTreg細胞發(fā)育[60]。

TGF-β不僅由Th3細胞產(chǎn)生，也由Foxp3+Treg產(chǎn)生，且表達表面分子GARP。Treg細胞表達表面分子GARP對誘導(dǎo)口服耐受至關(guān)重要[61]。 IL-6，IL-21和IL-35可抑制GARP在Foxp3+Treg細胞上的表達，從而抑制LAP和TGF-β。阻斷IL-6途徑可促進小鼠口服耐受[62]。過量IL-4也會抑制過敏原特異性Treg細胞的誘導(dǎo)，并在小鼠模型中引起腸道炎癥[63]。

3 誘導(dǎo)免疫耐受在食物過敏中的應(yīng)用

3.1 口服耐受

口服耐受（OIT）指：通過口服途徑預(yù)先施用抗原，達到特異性抑制細胞和體液免疫應(yīng)答的目的[64]?？诜褪茉谖改c道中發(fā)揮作用。為維持口服耐受性，腸相關(guān)淋巴組織繼續(xù)區(qū)分自身與非自身抗原，并識別可導(dǎo)致組織炎癥或腸道疾病的病原體。當(dāng)腸相關(guān)淋巴組織不能發(fā)揮功能時，該過程失效，導(dǎo)致口服耐受性喪失和不必要的過敏反應(yīng)[65]。影響口服耐受誘導(dǎo)的因素包括：抗原劑量、抗原來源、宿主遺傳信息、宿主正常菌群和宿主年齡[66]。

給予單次高劑量抗原或重復(fù)較低劑量后，小鼠可誘導(dǎo)口服耐受[67]。這兩種形式的耐受性，分別稱為高劑量耐受和低劑量耐受。高劑量的口服抗原可誘導(dǎo)淋巴細胞無能[68]或缺失[69]。高劑量耐受由淋巴細胞的無反應(yīng)性介導(dǎo)，可通過CD8+T細胞受體連接發(fā)生，或通過T細胞上的共刺激受體（CD28）和APC上的受體（CD80和CD86）相互作用發(fā)生，而不存在由可溶性細胞因子（如IL-2）提供的共刺激信號[70]。低劑量耐受由調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)。除上述抑制性CD8+T細胞外，不同類型的調(diào)節(jié)性CD4+T細胞在抗原的口服耐受性方面發(fā)揮了重要作用[71-73]。

口服耐受性也可由攜帶NK1.1標(biāo)記的肝相關(guān)淋巴細胞（NK1.1+T細胞）介導(dǎo)。通過腸上皮細胞后，抗原可能被吸收到毛細血管中，進入門靜脈，并且在肝臟中免疫細胞可能對這些抗原產(chǎn)生耐受性，此現(xiàn)象稱門靜脈耐受。通過在大鼠中進行門腔分流證明了發(fā)生這種機制的可能性，它是一種繞過肝臟抗原加工的過程，此過程不會對可溶性蛋白質(zhì)抗原產(chǎn)生耐受性[74]。通過結(jié)腸炎的實驗?zāi)Ｐ涂芍篘K1.1+T細胞為耐受介質(zhì)。NK1.1+T細胞的消耗加劇了這些動物的結(jié)腸炎癥[75]。

盡管已證明了OIT對脫敏的臨床療效，但通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)：進行全面的療效評估缺乏充分數(shù)據(jù)，仍存在安全性問題，需進一步評估[76-80]。一般以口為主的癥狀，其副作用屬輕度至中度，采用OIT治療可行性較強[81-85]。而對較嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，如全身性蕁麻疹/血管性水腫、喘息/呼吸窘迫、喉頭水腫、反復(fù)嘔吐，則效果不好。Skripak等[84]對牛乳過敏患者進行OIT治療時，發(fā)現(xiàn)45.4%OIT人員的癥狀與劑量有關(guān)，而只有11.2%安慰劑人員的癥狀與劑量有關(guān)，且大多是輕度和口咽的癥狀。

3.2 舌下免疫療法

舌下免疫療法（SLIT）是將食物過敏原提取物留在口腔中2～3 min，然后吐出或吞咽。此法的原理是：過敏原與口腔黏膜中致突變的朗格漢斯細胞相互作用，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受[86-87]。此過程中，過敏原被類似朗格漢斯細胞的樹突狀細胞捕獲在口腔黏膜內(nèi)，隨后樹突狀細胞成熟并遷移至近端引流淋巴結(jié)[88-89]。這些淋巴結(jié)形成了專門的微環(huán)境，通過產(chǎn)生封閉性IgG抗體（小鼠中的IgG2b）并誘導(dǎo)具有抑制功能的T淋巴細胞，有利于誘導(dǎo)黏膜耐受性[90-91]。最終，由于過敏原特異性活化的效應(yīng)T細胞在體內(nèi)進行循環(huán)并且產(chǎn)生的記憶細胞存活時間足夠長，在脫敏過程中局部（即舌下）施用過敏原會導(dǎo)致全身和黏膜保護性免疫應(yīng)答。與OIT相比，SLIT通常能獲得更好的治療效果，且治療過程中需要的過敏原劑量更低，但脫敏的臨床效果較差[92]。

SLIT方案有兩個階段：建立階段（在4至6周內(nèi)逐漸增加劑量）和維持階段（在幾年內(nèi)每周一次，最多3次給藥），后者起決定性作用。用此方案開展治療，給藥后幾天內(nèi)會發(fā)生：促炎癥細胞減少、IgG抗體上調(diào)和IL-10的產(chǎn)生[93]。幾個月內(nèi)會產(chǎn)生對Th1和Th2反應(yīng)及適應(yīng)性免疫的可檢測影響[93]。通常情況下，免疫治療后不久即可發(fā)現(xiàn)免疫學(xué)變化，但SLIT治療至少1年后才對癥狀有效，在2年后才觀察到最大益處[94]。但是，幾種SLIT的急診和超急診方案已經(jīng)證明：它可以在幾周甚至幾天內(nèi)使皮膚反應(yīng)性下降，并獲得易于檢測的臨床獲益[93,95-96]。SLIT誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用的持續(xù)時間少有報道，但幾項獨立研究表明：患有鼻結(jié)膜炎的兒童對草花粉或屋塵螨的SLIT可預(yù)防哮喘及新的過敏反應(yīng)[94，97-98]。Rienzo等對SLIT進行了長達10年的隨訪，推測此法基于免疫記憶機制[97]。

大量臨床經(jīng)驗證實：成人和幼兒對SLIT的耐受性都很好[99-101]。副作用通常發(fā)生在局部，包括口腔瘙癢、腫脹和刺激，且通常在給藥后數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，推測可能是IgE介導(dǎo)的反應(yīng)。因SLIT期間炎癥標(biāo)記物（如類胰蛋白酶）不會局部增加，舌下接收過敏原刺激后，口腔中發(fā)生的IgE介導(dǎo)反應(yīng)通常受到限制[102]。另外，在人體中進行的變應(yīng)原實驗已證實：舌下黏膜的反應(yīng)性至少比鼻黏膜或皮膚低10倍[103],可能是因為口腔黏膜中促炎癥細胞（如肥大細胞）較少。

盡管SLIT功效與過敏原劑量明顯相關(guān)，但高劑量方案未顯著提高全身或局部不良事件的發(fā)生頻率[104]。在體外，高劑量的過敏原在誘導(dǎo)肥大細胞釋放促炎癥介質(zhì)中的作用不如低劑量[105]。對于治療哮喘和過敏性鼻炎，SLIT可改善臨床癥狀并具有良好的安全性[99,106-107]。

3.3 表皮免疫療法

表皮免疫療法（EPIT）用含過敏原的貼片激活皮膚朗格漢斯細胞，隨后朗格漢斯細胞遷移至淋巴結(jié)并下調(diào)效應(yīng)細胞反應(yīng)[86,108-109]。動物實驗表明：EPIT誘導(dǎo)Th2型應(yīng)答下調(diào)，以重新平衡Th2/Th1[110]。EPIT可顯著提高所有過敏原的特異性IgG2a水平，從而降低IgE/IgG2a[111]。

這種表皮脫敏過程需要完整的皮膚屏障，為使EPIT有效，皮膚上層必須具有完整性，這突顯了最外層的皮膚免疫系統(tǒng)的重要性。角質(zhì)形成細胞構(gòu)成結(jié)構(gòu)屏障，并參與皮膚免疫應(yīng)答：角質(zhì)形成細胞能產(chǎn)生和分泌多種免疫試劑，且反應(yīng)迅速[112]。刺激后的表皮中TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、IL-1α、IL-1β和GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）水平升高，共同促進朗格漢斯細胞分化并激活成表皮內(nèi)樹突狀細胞[112]。角質(zhì)形成細胞可產(chǎn)生趨化因子，是全身性免疫細胞的主要募集信號[113]。在表皮層水平上，絲聚蛋白是人皮膚角質(zhì)層中表皮分化復(fù)合物的關(guān)鍵成分。特應(yīng)性濕疹患者中已顯示出絲聚蛋白功能喪失的突變[114-116]，并與過敏風(fēng)險增加相關(guān)[117-121]。因此，旨在恢復(fù)屏障功能的療法不僅在特應(yīng)性濕疹治療中發(fā)揮作用，也在預(yù)防過敏性疾病的進一步發(fā)展中發(fā)揮作用[121]。

與其他免疫療法技術(shù)相反，EPIT不需注射或口服過敏原，這是其安全性的基礎(chǔ)。對18名牛乳過敏的兒童（年齡0.8～7.7歲）進行了為期3個月的雙盲安慰劑對照試驗[122]。治療內(nèi)容包括背部3遍48小時貼劑（脫脂奶粉作為活性物質(zhì)），每周3次，幾乎沒有發(fā)生嚴(yán)重的全身性不良癥狀。這項試驗表明EPIT是安全的，EPIT具有前兩種方法無法比擬的優(yōu)勢。但是在花生過敏原的EPIT治療期間卻出現(xiàn)了持續(xù)副作用：局部紅斑/濕疹，并持續(xù)數(shù)天可見，從而造成中途退出率接近20%[81-83，123-124]。因此表皮免疫療法仍需要進一步完善。

4 展 望

食物過敏的根本解決方法是使機體產(chǎn)生免疫耐受，而非避食過敏原。目前對于免疫耐受的機制研究還不完善，且過敏個體差異性大，需進一步完善免疫耐受的機制，結(jié)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)個體產(chǎn)生免疫耐受。將誘導(dǎo)免疫耐受的機制引入到低致敏的奶粉研發(fā)中，既可保證奶粉的食用安全性，又可使牛乳過敏人群從中獲得較全面的營養(yǎng)素，這應(yīng)是未來開發(fā)相關(guān)低致敏產(chǎn)品目標(biāo)。