miR155調(diào)控TLR9信號通路對潰瘍性結(jié)腸炎的影響

李艷榮，李巖，靳遠(yuǎn)，郭蓮怡

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種長期且易反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常認(rèn)為是遺傳、免疫、腸道微生物等多種因素共同作用，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、膿血便等癥狀。UC的病理表現(xiàn)主要為炎癥和潰瘍，發(fā)病于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，可累及遠(yuǎn)端結(jié)腸及全結(jié)腸等部位。近年來，UC病發(fā)率不斷增加，可引發(fā)結(jié)腸癌，為難治性疾病之一[1]。

炎癥反應(yīng)，為機(jī)體的防御系統(tǒng)，當(dāng)受到微生物侵襲時，機(jī)體可通過炎癥反應(yīng)做出相應(yīng)保護(hù)。UC患者存在的腸道菌群失調(diào)、感染等因素，可產(chǎn)生內(nèi)毒素，而內(nèi)毒素中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究認(rèn)為Toll樣受休(toll like receptors，TLRs)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。TLR通過識別LPS，激活MyD88活化，誘導(dǎo)IRAKs磷酸化，進(jìn)而激活TRAF-6，TRAF-6識別IKK復(fù)合體，進(jìn)而導(dǎo)致NF-kB活化?；罨腘F-kB可促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)[3]。TLR9信號通路與腸道炎癥密切相關(guān)，可影響腸道粘膜生理功能[4]。

microRNA為非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄水平后抑制靶基因的表達(dá)或翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155為一種多功能基因，參與炎癥、免疫等生物反應(yīng)過程[5]。然而，miR-155是否通過調(diào)控TLR9信號通路影響潰瘍性結(jié)腸炎，還需要進(jìn)一步的研究與闡明。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/C小鼠20只，雄性，5～6 周齡，體重20～22 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2016-0002)。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗中心，相對濕度40%～60%，每日光照12 h，所有小鼠自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 建立UC模型及分組

采用含3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)飲水的方法建立UC小鼠模型。正常組小鼠10只予正常飲水15 d，UC模型組小鼠10只予含3%DSS飲用水連飲7 d，第8～15天予正常飲用水。

1.3 測定指標(biāo)及方法

每天觀察小鼠活動、飲水飲食等基本情況，用疾病活動指數(shù)(DAI)評估UC小鼠疾病狀態(tài)(DAI計算方法見表1)；實驗第14天晚上將小鼠禁食8 h，次日取材。眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠，置于冰上，從肛門上截取結(jié)腸標(biāo)本，測量，記錄長度；將結(jié)腸置于-80 ℃冰箱，用于后期的PCR和western blot實驗。將血液標(biāo)本離心，12 000 rpm，10 min，取上清，存于-80 ℃冰箱。采用ELISA法，按照試劑盒說明書，測定小鼠血清中炎癥因子鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin，CP)、IL-6、IL-1β、TNF-α等含量；比色法測定結(jié)腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性。

表1 DAI評分方法

1.4 PCR檢測指標(biāo)及方法

取出結(jié)腸組織，用 RNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 后進(jìn)行實時定量 PCR。使用 SYBR Green Real time PCR Master Mix 在 Roche Light Cycler 定量 PCR 儀上進(jìn)行 PCR 檢測，以 U6 為內(nèi)參檢測目的基因相對表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 20 s，連續(xù) 40 個循環(huán)。miR-155 相對表達(dá)量用 2-△△Ct描述。 miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α、GAPDH等因子引物序，見表2。

表2 引物序列

1.5 western blot檢測TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達(dá)情況

取小鼠結(jié)腸組織經(jīng) PBS 漂洗，組織裂解液提取總蛋白，聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，TLR9抗體(1∶500)、MyD88(1∶500)NF-κB抗體(1∶1000)過夜(所有抗體購自Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA)，TBST漂洗，孵育二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂洗，加入 ECL 暗室曝光，用 Image-J分析蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠體重、DAI和結(jié)腸長度比較

采用3%DSS構(gòu)建UC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)UC小鼠體重逐漸下降，與正常組小鼠比較，有顯著差異(P<0.05)；與正常組小鼠比較，UC小鼠DAI評分為(3.28±0.34)分，明顯升高(P<0.05)；此外，UC模型小鼠結(jié)腸長度為(3.52±0.18)cm，明顯低于正常組小鼠(7.05±0.37)cm，(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 結(jié)腸標(biāo)本

2.2 兩組小鼠結(jié)腸組織MPO活性比較

髓過氧化物酶(MPO)活性可間接反映小鼠結(jié)腸炎癥水平。從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠比較，UC模型小鼠MPO活性明顯增加，見圖2。

表3 兩組小鼠體重、DAI和結(jié)腸長度比較

*與正常組比較，P<0.05

2.3 兩組小鼠血清炎癥因子CP、IL-6、IL-1β、TNF-α比較

采用ELISA法測定血清炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，UC模型組小鼠CP、IL-6、IL-1β、TNF-α明顯增加，提示UC小鼠炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，見表4。

表4 兩組小鼠血清炎癥因子LPS、IL-6、IL-1β、TNF-α比較(pg/mL)

2.4 兩組小鼠結(jié)腸組織miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB以及IL-1β、TNF-α mRNA水平比較

如圖3所示，與正常組比較，UC模型小鼠的miR-155、TLR9、MyD88、NF-kB、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)明顯增加。結(jié)果提示，UC小鼠免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)被激活。

2.5 兩組小鼠TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達(dá)情況

與正常組比較，UC小鼠結(jié)腸組織TLR9、MyD88、NF-kB蛋白表達(dá)增加，提示TLR9信號通路可能參與UC的發(fā)生發(fā)展，見圖4。

*與正常組比較，P<0.05

*與正常組比較，P<0.05

3 討 論

UC發(fā)病率不斷增加，該疾病持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致結(jié)腸癌。UC發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，受多種因素的相互作用。目前，臨床藥物治療仍然存在療效不穩(wěn)定、較易復(fù)發(fā)以及毒副作用較大等情況。因而，進(jìn)一步研究UC的發(fā)病機(jī)制，或許為研發(fā)治療UC的藥物提供新的方向。UC患者普遍存在炎癥反應(yīng)失衡的問題，表現(xiàn)為促炎因子高表達(dá)，抗炎因子水平下降的情況，同時UC患者可檢測到多種自身抗體，抗炎和抑制免疫反應(yīng)從一定程度上改善UC患者的臨床癥狀，說明免疫功能紊亂與UC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。IL-1β、IL-6、TNF-α為重要的炎癥因子，鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin，CP)來源于中性粒細(xì)胞，其表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性，是中性粒細(xì)胞更新的重要標(biāo)志物。本文研究發(fā)現(xiàn)，UC組小鼠血清CP及結(jié)腸組織MPO水平明顯高于正常組。

Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)為一種跨膜受體，具有識別病原微生物、促進(jìn)抗菌基因表達(dá)及調(diào)控免疫反應(yīng)等作用，在全身各器官具有表達(dá)[7]。UC患者腸道因腸道菌群的影響，導(dǎo)致急性損傷，進(jìn)而引起相關(guān)信號通路的活化，促進(jìn)NF-kB等因子的表達(dá)增加，加劇炎癥反應(yīng)，使UC疾病惡化。TLR9是TLRs家族的重要成員，特異性地識別并結(jié)合細(xì)菌 DNA中具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸序列(cytosine phosphate-guanosine，CpG)，進(jìn)而激活小鼠的免疫細(xì)胞。TLR9在B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞具有表達(dá)[8]。TLR9通過識別未甲基化CpG，募集MyD88，MyD88與IRAK結(jié)合，觸動IRAK-1，進(jìn)而導(dǎo)致IRAK-1從復(fù)合體上解離，且與TRAF6相互作用，使TRAF6活化，進(jìn)而激活TAK1，導(dǎo)致IkB激酶磷酸化，使NF-kB釋放并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。NF-kB活化可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，使IL-6、TNF-α的生成增加。研究發(fā)現(xiàn)，UC大鼠結(jié)腸組織高表達(dá)TLR9、NF-kB，且與疾病惡化程度相關(guān)[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠結(jié)腸組織TLR9、MyD88、NF-kB的mRNA和蛋白明顯高于正常組小鼠，且UC小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯高于正常組。提示，TLR9/NF-kB信號通路在UC發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

miR-155位于人類21號染色體上，其表達(dá)水平受B細(xì)胞整合簇基因(B-cell integrationcluster，BIC)轉(zhuǎn)錄水平和miRNA加工等調(diào)控。脂多糖(LPS)刺激單核細(xì)胞可導(dǎo)致miR-155表達(dá)增加，而miR-155抑制劑可通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)的抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)/ NF-kB信號通路下調(diào)LPS刺激的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者肌成纖維細(xì)胞(intestinal myelofibrosis，IMF)中 miR-155的表達(dá)明顯高于正常患者，miR-155可以通過抑制SOCS1表達(dá)，調(diào)節(jié)IMF炎癥表型，從而影響UC發(fā)生發(fā)展[10]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155在UC模型小鼠中的表達(dá)明顯增加，同時伴隨IL-1β、TNF-α及TLR9/NF-kB信號通路表達(dá)增強(qiáng)。提示，miR-155可能通過調(diào)控TLR9信號通路參與UC的炎癥反應(yīng)，抑制該信號通路可能為治療UC的一個潛在靶點。