遼河口沉積物反硝化過程研究
——以反硝化功能基因豐度及nirK 型細菌群落結(jié)構(gòu)分析為例

明紅霞，陳泉睿,3，史銀銀,，蘇潔，于穎，樊景鳳*

( 1. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心 國家生態(tài)環(huán)境保護近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，遼寧 大連 116023；2. 大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026；3. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

1 引言

氮元素作為生物體所必需的營養(yǎng)元素，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用，是限制海洋生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的關(guān)鍵因子之一[1]。氮的轉(zhuǎn)化途徑復(fù)雜多變，反硝化過程是全球近岸海洋沉積物氮循環(huán)脫氮的關(guān)鍵反應(yīng)過程，異養(yǎng)細菌利用硝酸鹽作為呼吸末端的電子受體，將海洋環(huán)境中的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原為N2O 和N2兩種氣態(tài)產(chǎn)物，主導(dǎo)著海洋生態(tài)系統(tǒng)的脫氮過程，進而去除水體中的氮元素，控制富營養(yǎng)化發(fā)生速率[2]。主導(dǎo)反硝化過程的主要功能基因有：調(diào)控硝酸鹽向亞硝酸鹽還原的narG 基因、將亞硝酸鹽還原為NO 的nirK 基因、控制NO 還原為N2O 的norB基因、使得N2O 生成N2的nosZ 基因。

Helen 等[3]從反硝化過程的角度認(rèn)為，參與反硝化的還原劑至少應(yīng)當(dāng)能夠完成NO2?到氣態(tài)NO 的轉(zhuǎn)化，并從中獲取能量，該過程離不開亞硝酸還原酶的作用。亞硝酸還原酶將亞硝酸鹽還原為絕大多數(shù)生物都不可利用的氣態(tài)NO。常見的亞硝酸鹽還原酶有兩種，分別是由nirS 功能基因編碼的細胞色素cd1 亞硝酸還原酶和由nirK 基因編碼的Cu 依賴性亞硝酸還原酶，它們功能相同但結(jié)構(gòu)不同[4]。通常認(rèn)為nirS 型反硝化菌具有更高的基因豐度，在環(huán)境中占據(jù)了主導(dǎo)地位，而nirK 型反硝化菌則存在于更為廣泛的微生物種群中，涵蓋了更為多樣的分類單元，nirK功能基因所主導(dǎo)的反硝化過程在環(huán)境中的地位也一直被低估[4–5]。研究表明，nirK 型反硝化菌在對不同環(huán)境梯度的響應(yīng)中表現(xiàn)出了更為強大的生境選擇[6–7]。對nirK 型反硝化細菌的研究，可以幫助我們進一步認(rèn)識和了解nirK 型反硝化細菌在環(huán)境中的獨特地位，進而對近岸海洋氮循環(huán)過程做出更加正確、合理的推斷。

河口是連接河流與海洋的過渡地帶，是水圈、巖石圈和大氣圈的重要交匯地區(qū)，也是微生物地球化學(xué)循環(huán)最為活躍的地區(qū)[8]。河口沉積物是海洋微生物反硝化作用的重要發(fā)生地和富集地，也是氮素及營養(yǎng)鹽重要的源和匯[8]。遼河口位于遼寧省盤錦市河流入海的過渡地帶，屬暖溫帶季風(fēng)氣候區(qū)，降水多集中于7?9 月[9]。遼河口河流含沙量較高，水文及理化條件復(fù)雜，環(huán)境因子多變。遼河口區(qū)域為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟生產(chǎn)活動提供了豐富的海洋和生物資源，而大量陸源營養(yǎng)物質(zhì)隨河流搬運作用進入遼東灣海洋生態(tài)系統(tǒng)，引發(fā)了遼河口水質(zhì)下降、水體富營養(yǎng)化[10]等，這些污染對河口氮循環(huán)微生物群落造成了不同程度的干擾。

本研究以熒光定量PCR 的方法測定了遼河口沉積物反硝化過程關(guān)鍵功能基因的豐度，采用高通量測序技術(shù)對nirK 型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行解析，并進一步分析了細菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，可以幫助我們進一步探究反硝化細菌在河口生態(tài)環(huán)境中的分布及其生態(tài)策略，以期為河口或近岸海域水資源保護和生態(tài)環(huán)境治理提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

2 方法

2.1 樣品采集

實驗樣品采集于2016 年7 月，在遼河口區(qū)域按照河口向海延伸方向設(shè)置12 個采樣站位，按照鹽度梯度劃分為3 組（鹽度0.8～7.0 為近岸淡水組，圖1 中C 組；鹽度13.1～20.7 為混合鹽度組，圖1 中B組；鹽度25.5～31.5 為高鹽度組，圖1 中A 組），采樣站位布設(shè)如圖1 所示。使用有機玻璃采水器收集各站位的底層水，保存于無菌玻璃瓶中，在4℃條件下保存并運回實驗室，用以測量其他理化參數(shù)。在各個采樣站位隨機抓取3 斗海洋沉積物，將3 斗沉積物樣品混勻均質(zhì)化形成復(fù)合樣品，用無菌密封袋保存，在?20℃冷藏運輸回實驗室，分裝后部分樣品于?80℃長期保存。

圖1 遼河口12 個采樣點站位布設(shè)及分組情況Fig. 1 Distribution and grouping of 12 stations in Liaohe Estuary

2.2 環(huán)境參數(shù)測定

將YSI 水質(zhì)測量儀（SG23-FK-ISM，上海）直接放進水層底部，實時測量水溫、鹽度、pH 和電導(dǎo)率等數(shù)據(jù)。實驗室利用碘量法測定底層水溶氧值，萘乙二胺分光光度法測定 NO?2含量，鋅鎘還原法測定 NO?3含量，次溴酸鹽氧化法測定 NH+4含量，磷鉬藍分光光度法測定 PO34?含量。使用激光粒度分析儀（LS13320SW，美國）測定沉積物粒度，重鉻酸鉀氧化還原容量法測定沉積物中總有機碳含量，分光光度法測定總磷含量，凱式滴定法測定總氮含量。本研究的環(huán)境參數(shù)與文獻[11]一致（詳細參數(shù)見表1，表2）。

2.3 DNA 提取及qPCR 技術(shù)

在各采樣站點取0.35 g 海洋沉積物，使用DNeasy PowerSoil Kit 試劑盒（Qiagen，德國）提取沉積物中的DNA，各站位取3 組平行樣品，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒提取步驟進行。使用微量紫外分光光度計（Scandrop 200，德國）測定DNA 的純度和濃度，使用Goldview 核酸染料（Solarbio，北京）對提取到的DNA染色，以1.5%的TAE-瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性。分別構(gòu)建各功能基因的質(zhì)粒，采用熒光定量PCR 儀（ABI-7 500 型號，APPLIED BIOSYSTEM）依次測定組成反硝化過程的4 個主要功能基因：硝酸鹽還原酶基因narG、亞硝酸鹽還原酶基因nirK、一氧化氮還原酶基因norB 和一氧化二氮還原酶基因nosZ 的豐度，功能基因的引物見表3。

qPCR 擴 增體系為：10 μL 的TB Green Premix Ex Taq II（寶生物，大連），上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，ROXII（寶生物，大連）0.4 μL，DNA 模板2 μL 和6.8 μL的ddH2O（寶生物，大連），設(shè)置陰性對照和3 組平行。梯度PCR 確定narG、nirK、norB、nosZ 4 個反硝化功能基因引物的最佳退火溫度分別為51℃、57℃、55℃和59℃。選擇插入所需目的基因DNA 片段的質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過觀察熔解曲線檢驗擴增產(chǎn)物的特異性。qPCR 技術(shù)測定目的基因的擴增效率應(yīng)在80%～105%之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99。

2.4 高通量測序技術(shù)

將nirK 型反硝化功能基因作為反硝化細菌的代表功能基因，對其進行高通量測序。使用與qPCR 相同的特異性引物對nirK 基因進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（寶生物，大連）回收目的條帶。委托上海微基生物科技有限公司使用2×300 bp 末端堿基配對，通過Illumina MiSeq 平臺對nirK 基因文庫進行高通量測序。測序完成后，根據(jù)barcode 標(biāo)簽篩選有效序列并區(qū)分樣品來源，對有效序列進行定量質(zhì)量控制和序列拼接，優(yōu)化基因序列，去除低質(zhì)量序列和小于50 bp 的短序列。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用軟件 USEARCH 將有效序列確定為分類操作單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），序列相似性在97%以上的OTUs 進行聚類，分析細菌群落結(jié)構(gòu)的α 多樣性。Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Coverage 指數(shù)通過Mothur v.1.32.1對OTU 進行計算，分析環(huán)境樣品中OTU 數(shù)目組成的相似性和重疊情況。使用R 語言建立韋恩圖、花瓣圖以及RDA 冗余分析圖。采用SPSS 23.0 對環(huán)境參數(shù)與基因豐度進行Pearson 相關(guān)分析，顯著性水平設(shè)定為p<0.05。通過R 語言及語言包完成分析多樣性指數(shù)和環(huán)境因子之間的關(guān)系，LEfSe 分析采用線型判別分析。通過LEfSe 軟件進行組間群落差異分析。將Illumina 測序原始序列提交至GenBank。

表1 遼河口底層水中環(huán)境因子理化參數(shù)[11]Table 1 Physical and chemical parameters of environmental factors in bottom water of the Liaohe Estuary[11]

表2 遼河口表層沉積物中環(huán)境因子理化參數(shù)[11]Table 2 Physical and chemical parameters of environmental factors in surface sediments of the Liaohe Estuary[11]

表3 反硝化功能基因的引物Table 3 Primers for denitrification genes

2.6 基因序列登錄號

本研究中高通量測序得到的nirK 型反硝化功能基因的原始序列已經(jīng)登陸至NCBI 數(shù)據(jù)庫，基因序列登 錄 號 為SRR8907784、SRR8907785、SRR8907786、SRR8907787、SRR8907789、SRR8907790、SRR8907791、SRR8907792、SRR8907793、SRR8907794、SRR8907795和SRR8907796。

3 結(jié)果

3.1 反硝化功能基因在遼河口表層沉積物中的豐度分布

采用qPCR 技術(shù)的方法測定narG、nirK、norB、nosZ 4 個功能基因在遼河口沉積物中的豐度，結(jié)果如圖2所示。narG 型反硝化功能基因的豐度分布在1.63×108～1.13×109copies/g，平均豐度為5.92×108copies/g，在B1 站位反硝化功能基因豐度最高，在C4 站位基因豐度最低。nirK 型反硝化功能基因的平均豐度為2.33×107copies/g，在B1 站位豐度最高，為5.58×107copies/g，在C4 站位豐度最低，為2.12×106copies/g。norB 型反硝化功能基因的平均豐度為9.13×106copies/g，C3 站位基因豐度最高，為2.72×107copies/g；A2 站位基因豐度最低，為2.60×106copies/g。nosZ 型反硝化功能基因平均豐度為1.35×108copies/g，在B1 站位豐度最高，為1.03×108copies/g；C4 站位豐度最低，為6.48×107copies/g。

從分組數(shù)據(jù)可以看出，在遼河口12 個站位中narG基因豐度最高，norB 基因豐度最低。narG、nirK、nosZ 型反硝化功能基因的相關(guān)性較好，其豐度的最高值都出現(xiàn)在淡咸水混合組，最低值出現(xiàn)在低鹽度組。norB 型反硝化功能基因豐度表現(xiàn)出隨鹽度升高而豐度降低的趨勢，nosZ 型反硝化功能基因的豐度與narG、nirK 相比分布更為均勻，在按鹽度梯度劃分的分組中差異最小。

對遼河口12 個站位的環(huán)境因子與功能基因豐度進行皮爾遜相關(guān)性分析，圖3 中紅色表示兩個變量呈正相關(guān)關(guān)系，綠色為負相關(guān)關(guān)系。在功能基因豐度上，narG 與nirK、narG 與nosZ 以及nirK 與nosZ 之間均具有顯著相關(guān)性（p＜0.05），其中narG 與nirK 型基因豐度與沉積物粒徑也表現(xiàn)出了顯著相關(guān)性，與其他環(huán)境因子無顯著相關(guān)性，而調(diào)控著NO 向N2O 轉(zhuǎn)化的norB 基因豐度與鹽度、pH、 NO?2含量、 PO34?含量具有顯著相關(guān)性，與N H+4含量、N O?3含量具有極顯著相關(guān)性。

3.2 nirK 型反硝化細菌多樣性

對遼河口12 個采樣點站位表層沉積物進行nirK型反硝化功能基因高通量測序，測出有效序列數(shù)、數(shù)據(jù)覆蓋度，對所測得的數(shù)據(jù)進行OTUs 分類，并計算其豐度和多樣性指數(shù)，結(jié)果如表4 所示。

圖2 遼河口narG、nirK、norB、nosZ 功能基因豐度Fig. 2 Functional gene abundance of narG, nirK, norB, and nosZ in the Liaohe Estuary

圖3 遼河口環(huán)境因子與功能基因豐度的皮爾遜相關(guān)性Fig. 3 Pearson correlation between environmental factors and the abundance of functional genes in the Liaohe Estuary

樣品中的Coverage 指數(shù)最小值為99.89%，表明高通量測序的結(jié)果基本覆蓋了所有的樣本信息，可以客觀地反映樣品中nirK 型反硝化細菌群落的真實信息。Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)可以反映出基因豐富度。由表4 可以看出，在低鹽度C 組中菌群豐富度較高，高鹽度A 組中菌群豐富度較低。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)則可以估算樣品中細菌群落的多樣性，二者皆表明低鹽度組具有更為豐富的物種多樣性，高鹽度組微生物物種群落結(jié)構(gòu)較為單一。本次高通量測序在12 個站位中共得到417 272 個有效序列，將這些序列進行聚類分析，一致性在97%以上的聚為1 個OTU。對遼河口nirK 型反硝化功能基因的測序共得到619 個OTUs 序列，從韋恩圖（圖4a）中可以比較直觀的看出各采樣點中OTUs 數(shù)目組成的相似性和重疊情況。高鹽度A 組、混合區(qū)B 組、低鹽度C 組分別含有219 個、328 個、480 個OTUs，3 組樣品共有的OTUs 是126 個。低鹽度組中OTUs 數(shù)最多，其次是淡咸水混合組，高鹽度組的OTUs 最少，原因可能是鹽度的脅迫篩選了特定的菌屬?；ò陥D（圖4b）可以表示出12 個采樣站位中獨有和共有的OTUs 數(shù)目，其中最大OTUs 值為305 個，出現(xiàn)在C2 采樣點，最小OTUs 為96 個，出現(xiàn)在A2 站位；12 個采樣點共有的核心OTUs 為30 個。

表4 遼河口nirK 型反硝化細菌豐度及多樣性Table 4 Abundance and diversity of nirK-type denitrifying bacteria in the Liaohe Estuary

3.3 nirK 型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)組成及差異分析

根據(jù)高通量測序結(jié)果對OTU 進行注釋，發(fā)現(xiàn)在遼河口nirK 型反硝化細菌共有7 個門、9 個綱、23 個目、36 個科、63 個屬、121 個種。其中變形菌門（Proteobacteria）占絕對優(yōu)勢地位，在各站位菌門中最低比例為99.37%，平均值為99.83%。在屬水平上，優(yōu)勢菌主要為德沃斯氏菌（Devosia）、海洋嗜酸桿菌（Phaeobacter）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）、假單胞菌（Pseudomonas），約占總菌屬的68.97%，詳見圖5。

圖4 nirK 型功能基因OTUs 分布的韋恩圖（a）和花瓣圖（b）Fig. 4 Venn diagram (a) and petal map (b) of the nirK functional gene OTUs distribution

從圖5 中可以看出，德沃斯氏菌和產(chǎn)堿桿菌在高鹽度組向低鹽度組的過渡中豐度逐漸下降，海洋嗜酸桿菌在混合鹽度區(qū)擁有最大豐度，而假單胞菌則在近岸淡水組呈現(xiàn)最大豐度。

按鹽度梯度的劃分，對nirK 型反硝化細菌群落進行線性判別分析，構(gòu)建了細菌的進化分支樹圖和線性判別分析（LDA）值分布柱狀圖（圖6）。進化分支樹圖由內(nèi)向外的每層圓弧分別代表了門、綱、目、科、屬、種，共6 個水平層次上的細菌群落結(jié)構(gòu)分布。發(fā)育樹各樹枝節(jié)點的顏色代表細菌的分組情況，節(jié)點的直徑大小與該物種的相對豐度正相關(guān)。LDA 值分布柱狀圖顯示了大于預(yù)設(shè)值2.0 的具有顯著差異性的物種。將圖6 各分組中的生物標(biāo)志物對應(yīng)到屬水平，可以得出產(chǎn)堿桿菌、德沃斯氏菌、假單胞菌、根瘤菌（Rhizobium）、無色桿菌（Achromobacter）為A 組的生物標(biāo)志物，在高鹽度中發(fā)揮著重要的作用。而低鹽度C 組中起著重要作用的菌屬為假單胞菌、Defluviimonas、螯 臺 球 菌 屬（Chelatococcus）、 中 慢 生 根 瘤 菌（Mesorhizobium）、胺桿菌屬（Aminobacter）、副球菌屬（Paracoccus）、褐桿菌屬（Phaeobacter）等。我們在淡咸水混合的B 組沒有檢出具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)志物?！?/p>

選擇冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）圖（圖7）分析不同類別OTUs 的組成來反映樣本間的差異，可以得到遼河口nirK 型反硝化細菌群落組成與張慧珍等[11]測得的環(huán)境因子之間的相關(guān)性，其中RDA圖的總貢獻度為80.93%，在很大程度上可以解釋環(huán)境因子變量與采樣站位細菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。鹽度、pH、溶解氧和亞硝酸鹽等環(huán)境因子對細菌微生物群落有更明顯的影響作用。德沃斯氏菌、產(chǎn)堿桿菌、Breoghania的群落豐度與鹽度、pH 正相關(guān)，與NH+4、 PO34?、 NO?2含量負相關(guān)。海洋嗜酸桿菌與 NO?3含量正相關(guān)，與DO 含量呈現(xiàn)出明顯的負相關(guān)，假單胞菌與鹽度具有顯著的負相關(guān)關(guān)系。其中，N O?2含量、pH、NH+4對nirK 型細菌群落結(jié)構(gòu)的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05，蒙特卡洛檢驗1 000 倍）。

圖5 nirK 型反硝化細菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig. 5 Histogram of community structure at the genus level of nirK-type denitrifying bacterias

圖6 基于LEfSe 分析的遼河口沉積物中nirK 型反硝化細菌的豐度柱狀圖(a)和進化分支圖(b)Fig. 6 Abundance histogram (a) and evolutionary branch map (b) of nir K-type denitrifying bacteria in the sediments of the Liaohe Estuary based on LEfSe analysis

圖7 nirK 型反硝化細菌群落與環(huán)境因子變量的冗余分析圖Fig. 7 Redundancy analysis of nirK-type denitrifying bacteria community and environmental factor variables

4 討論

4.1 遼河口反硝化基因豐度分析

功能基因的豐度可以反映遼河口潛在的反硝化能力。narG 基因豐度最高，表明硝酸鹽還原作用在遼河口反硝化過程中的重要地位，較高的基因豐度也可能是由部分細菌基因組內(nèi)存在多個基因拷貝數(shù)所引起的；norB 基因隨河口鹽度升高而豐度降低，呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律變化，我們推測在遼河口區(qū)域NO 的還原過程主要發(fā)生在淡水輸入比較突出的低鹽度區(qū)域。narG、nirK 和nosZ 3 個功能基因的豐度均在鹽水?淡水的過渡混合區(qū)沉積物中最高，其中nosZ 在各鹽度組中的豐度變化最小，其原因可能為混合區(qū)復(fù)雜的環(huán)境條件為其提供了更加多樣化的生存條件。對反硝化功能基因的豐度進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明narG、nirK 和nosZ 功能基因之間表現(xiàn)出兩兩顯著相關(guān)，進一步說明了遼河口 NO?3還原和N2生成的潛力較高，與環(huán)境因子的相關(guān)性較弱，受河口環(huán)境因子變化的影響較小。皮爾遜相關(guān)性分析中也指出narG 和nirK功能基因的豐度與沉積物粒徑呈顯著相關(guān)性（圖3）。沉積物粒徑與原位水文條件密切相關(guān)，可以通過河流徑流、淡咸水混合強度，對其他物理化學(xué)特性的動態(tài)控制，進而影響反硝化細菌群落的豐度和多樣性[15]。Jiang 等[16]在中國長江口的研究結(jié)果也表明沉積物類型是預(yù)測nirK 型反硝化細菌豐度和群落組成的關(guān)鍵因子。雖然反硝化是由多個不同的功能基因所調(diào)控，但是反硝化作用的發(fā)生可能是由環(huán)境中某一類優(yōu)勢菌群所主導(dǎo)，從高通量測序的注釋結(jié)果可以看出在遼河口反硝化菌群中99.37%以上的菌群均隸屬于變形菌門，這也可能是反硝化功能基因豐度之間具有較高相關(guān)性的原因。

研究中，個別站點的局部差異影響功能基因豐度的分布，但該差異并沒有造成大范圍區(qū)域性的影響。這提醒我們在今后的研究中設(shè)置更多的采樣站位，以消除局部空間誤差對實驗帶來的影響，從而更好地解釋河口地區(qū)復(fù)雜生境下功能微生物的分布和群落特征。

4.2 遼河口nirK 型反硝化細菌群落生態(tài)功能分析

對nirK 型反硝化功能基因的高通量測序發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）在遼河口亞硝酸鹽還原菌中的豐度和多樣性最高，在遼河口沉積物中變形菌門為起到重要作用的優(yōu)勢菌群，這與Yang 等[17]在遼河口的研究一致。此外，本研究中所使用的nirK 引物主要擴增出α-變形菌綱的基因片段，但是 Helen 等[3]也指出，nirK 型反硝化細菌還存在于更廣泛的細菌分類中，包括以放線菌門、厚壁菌門等為主的Clade II 類群。遼河口環(huán)境中也可能存在著更高的反硝化菌豐度和更豐富的群落多樣性，其中德沃斯氏菌、海洋嗜酸桿菌、產(chǎn)堿桿菌和假單胞菌占據(jù)較大的豐度。

有研究表明，在突尼斯北部海岸[18]、智利中部金特羅灣（Quintero Bay）[19]被石油污染的海洋沉積物中同樣分離出了產(chǎn)堿桿菌，且該菌種可利用石油、原油以及其他碳氫化合物作為唯一碳源，產(chǎn)生生物表面活性劑，同時具有重金屬抗性基因，可以適應(yīng)有毒化合物、高鹽、氧化脅迫等環(huán)境條件，其生物降解能力可用于原位生物修復(fù)等[18]。遼東灣北部區(qū)域蘊藏著豐富的石油和天然氣資源，陸源營養(yǎng)物質(zhì)的輸入對沉積物中的菌屬進行了特定的篩選，這些特定菌屬的大量存在可能對海洋環(huán)境中石油和天然氣等資源的分布具有潛在的指向作用。在太平洋東海岸[20]、韓國所測的東海的淡咸水交界處[21]以及波蘭地區(qū)的東南部[22]也都檢測并分離出了德沃斯氏菌，且證實了該菌屬與水生植物的固氮和結(jié)瘤共生有著密切的聯(lián)系[23]。德沃斯氏菌在遼河口沉積物中除了參與氮循環(huán)的反硝化過程，也極有可能參與了微生物固氮的過程，并在兩種過程中發(fā)揮重要作用，對該菌屬下的細菌還有待更深入的研究。海洋嗜酸桿菌在南海[24]、丹麥港口[25]等海域中也被檢測出，它可以利用環(huán)境中的銨鹽，增加生物體內(nèi)的氮積累，并分泌某種物質(zhì)從而保證自己免受其他微生物的捕食，其生命活動與海洋及河口中還原性氮的分布密切相關(guān)[26]。

4.3 環(huán)境因子對反硝化細菌的影響

環(huán)境因子與反硝化細菌群落的相關(guān)性表明，細菌群落對環(huán)境因子的響應(yīng)不是一成不變的，而是多種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果。從張慧珍等[11]的研究中可以看出，在B1 采樣點沉積物主要為黏土和粉砂，其粒徑較小，而C4 采樣點沉積物中含有84.88%的砂粒，有文獻指出，按照沉積物粒徑劃分的黏土、粉砂、砂在沉積物中所占的比例可以影響基因的拷貝數(shù)，黏土和粉砂中的細菌豐度更高[27–28]，較高的含砂比是造成采樣站位功能基因豐度較低的主要原因。

nirK 型反硝化功能基因的豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)表明，nirK 型功能基因在淡水沉積物中具有更高的OTU 數(shù)目和更為豐富的物種多樣性。有研究指出，反硝化細菌的多樣性及其分布受鹽度的影響，在鹽度發(fā)生變化時，反硝化細菌表現(xiàn)出隨鹽度波動的抗性或阻力[29]。我們的研究結(jié)果也進一步證實了鹽度在nirK 型反硝化細菌群落組成和多樣性中的重要性。Liu 等[30]在對長江口沉積物的研究中指出水的理化性質(zhì)和養(yǎng)分組成是預(yù)測河口沉積物中反硝化作用和N2O 生成速率的主要影響要素。同時，Zhou 等[31]的研究提出溫度是影響細菌反硝化群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵環(huán)境因子之一。nirK 型反硝化菌群主導(dǎo)著反硝化過程中 NO?2向NO 的轉(zhuǎn)化，其中 NO?2是反硝化過程中的電子受體，并且 NO?3與 NO?2濃度的比值影響反硝化菌群的多樣性[32]。以上觀點也佐證了鹽度、DO 以及NO?2含量與nirK 型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)具有較大影響的觀點。

本研究探究了在遼河口沉積物反硝化作用中主要的功能基因和反硝化優(yōu)勢菌，同時分析了環(huán)境因子對于功能基因豐度和細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在為河口環(huán)境富營養(yǎng)化中氮元素的循環(huán)提供理論依據(jù)。

5 結(jié)論

(1) 功能基因的豐度在不同反硝化過程中存在差異。narG 基因占據(jù)最高基因豐度，而norB 基因隨河口向海延伸而豐度下降，且與多數(shù)環(huán)境因子具有顯著相關(guān)性。功能基因narG、nirK 和nosZ 之間具有顯著相關(guān)性。

(2) 遼河口的鹽度梯度對nirK 型反硝化細菌群落的影響顯示出：高鹽度組中主要作用菌屬為產(chǎn)堿桿菌屬、德沃斯氏菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬等；近岸低鹽度組中主要作用菌屬為假單胞菌屬、Defluviimonas、螯臺球菌屬、中慢生根瘤菌屬、胺桿菌屬等；在淡水?咸水的混合交界組中沒有篩選出有差別作用的重要菌屬。

(3) 遼河口沉積物中反硝化細菌的豐度主要受沉積物粒徑（泥砂比）的影響。nirK 型反硝化細菌多樣性隨河口向海延伸逐漸下降，沉積物的鹽度、pH、DO 以及 NO?2含量是影響nirK 型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。