妊娠晚期B族鏈球菌血清型及耐藥情況的分析研究

施 維 李宗光 吳 湃 張斗星 胡安群

B型鏈球菌（GBS）是β溶血的革蘭陽性鏈球菌，不同地域、人群的妊娠期婦女帶菌率稍有差別，一般為6.5%～36%。GBS感染是孕產(chǎn)婦及新生兒感染的主要致病菌之一，可引起孕產(chǎn)婦敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、產(chǎn)褥期感染、羊膜炎等，并與早產(chǎn)、胎膜早破及晚期流產(chǎn)等有關(guān)；GBS也已成為新生兒出生后2 個(gè)月內(nèi)肺炎、腦膜炎和敗血癥的最常見致病菌[1]。本研究對(duì)GBS陽性的菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)及血清分型，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，并根據(jù)血清分型結(jié)果評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度及后續(xù)疫苗的研發(fā)。

1 資料與方法

1.1 一般資料和樣本采集 經(jīng)知情同意后，選取2017 年10 月-2018 年4 月在我院產(chǎn)科住院或產(chǎn)科門診就診的608 例孕35～41 周孕婦，取孕婦陰道下段及直腸分泌物的標(biāo)本，進(jìn)行GBS篩查，陽性者為觀察組，陰性者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)為20～42 歲孕婦，所有孕婦近期無性交或抗生素應(yīng)用史，孕周均經(jīng)末次月經(jīng)、早孕B超和胎動(dòng)時(shí)間等確認(rèn)。排除有習(xí)慣性流產(chǎn)、有其他明顯感染因素、有嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥及內(nèi)科疾病的孕婦。對(duì)篩選后的孕婦一般資料進(jìn)行分析，如平均年齡及孕周。

1.2 檢測方法

1.2.1 普通培養(yǎng)法 將取材標(biāo)本直接劃線接種血平板上，在37 ℃有氧條件下培養(yǎng)18～24 h。GBS陽性菌落在血平板內(nèi)呈灰白色、透光、濕潤、光滑、凸起狀。將可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，觸酶試驗(yàn)陰性，環(huán)磷酸腺苷試驗(yàn)陽性，馬尿酸試驗(yàn)陽性。篩查中凡符合上述特征之一者即為陽性，否則為陰性。

1.2.2 顯色平板法 將取材標(biāo)本直接劃線接種B群鏈球菌顯色平板（安圖生物工程股份有限公司），于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，按說明書判斷結(jié)果。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 B族鏈球菌核酸檢測探針、引物均由福建泰普生物科學(xué)有限公司提供；檢驗(yàn)方法如下：取含有妊娠35～41 周孕婦生殖道或直腸分泌物，離心沉淀。沉淀物用100 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）緩沖液重懸，再加入10 μL內(nèi)參照。高速震蕩5 min破碎細(xì)胞，離心后95 ℃干浴2 min，冰浴5 min，13000 r/min高速離心1min，取上清液5 μL加入PCR反應(yīng)管中。PCR擴(kuò)增10 個(gè)循環(huán)。在55 ℃,45 s末端收集熒光。根據(jù)熒光定量結(jié)果判定陰陽性。

1.3 GBS陽性結(jié)果的判定 普通培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)法任一結(jié)果檢出并經(jīng)生化鑒定為GBS，即為GBS帶菌者。GBS培養(yǎng)都為陰性而實(shí)時(shí)熒光定量PCR法為陽性者，判定為GBS帶菌者。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法為陰性而任一培養(yǎng)法為陽性并經(jīng)生化鑒定為GBS，也判定為帶菌者。三種方法檢測結(jié)果均為陰性者則判定未攜帶GBS者。

1.4 藥物敏感試驗(yàn) 針對(duì)鑒定為GBS陽性的孕婦，取菌液涂布M-H平板，貼上青霉素、頭孢噻肟、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素、萬古霉素7 種藥物紙片，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，判讀結(jié)果；操作及藥敏結(jié)果判斷嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.5 GBS血清分型 Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ 10 種乳膠凝集分型血清試劑購自丹麥血清研究所，操作步驟及判讀方法參考試劑盒的說明書。若菌株與 10 種分型血清均不發(fā)生凝集，定義為不可分型（NT）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 圍產(chǎn)期孕婦的帶菌情況及一般情況的分析 608例圍產(chǎn)期孕婦中檢測為GBS陽性的有65例，帶菌率為10.6%。普通培養(yǎng)法GBS陽性菌落在血平板內(nèi)呈灰白色、透光、濕潤、光滑、凸起狀（見圖1A）。顯色平板法GBS為粉色或紅色（見圖1B）。普通培養(yǎng)法，顯色平板法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法三種不同方法的檢出率見表1。普通培養(yǎng)法的陽性率和特異度也顯著低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和顯色平板法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GBS陰性組孕婦的平均年齡為（30.46±5.39）歲，平均孕周為（38.12±1.67）周；GBS陽性組平均年齡為（30.71±4.67）歲，平均孕周為（37.63±1.73）周，兩組孕婦的年齡與孕周間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 GBS菌落形態(tài)

表1 三種方法檢測出GBS的結(jié)果比較

2.2 GBS陽性菌株的藥敏試驗(yàn) 對(duì)培養(yǎng)檢出的58 株GBS陽性菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中對(duì)青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素的敏感性為100%，對(duì)紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素的耐藥率分別為48.2%、37.9%、36.2%、29.3%。見表2。

表2 58例GBS菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 GBS血清型的分布 在58 例GBS陽性的菌株中，血清分型所占比例分別為Ⅲ型44.8%（26株），Ⅰb型19.0%（11 株），Ⅴ型13.8%（8 株），Ⅰa型12.1%（7 株），Ⅱ型3.4%（2 株），6.9%（4株）的菌株未檢出分型。

3 討 論

目前，我國的GBS在孕婦中的攜帶率約為5%～15%[2]，與本文研究結(jié)果一致。GBS常定值于人類的下消化道、泌尿道及陰道，妊娠期間孕婦的免疫功能下降，導(dǎo)致陰道內(nèi)微環(huán)境的菌群失調(diào)，從而易造成感染。故GBS是引起圍產(chǎn)期婦女生殖道感染的首要致病菌[3]，孕婦感染GBS后早產(chǎn)率明顯增高。其次，GBS也會(huì)增加新生兒感染的發(fā)病率，造成新生兒肺炎、敗血癥及腦膜炎等，病死率極高。

目前檢測GBS感染的方法有很多種，美國疾病預(yù)防控制中心推薦普通培養(yǎng)加生化鑒定為檢測GBS的金標(biāo)準(zhǔn)。但普通培養(yǎng)法檢出率較低，本研究顯示僅為6.9%，而顯色平板的檢出率為9.5%，明顯高于普通培養(yǎng)法，這是由于顯色平板上添加了特異性的酶底物，經(jīng)GBS的酶解作用釋放出顯色原從而使菌落呈現(xiàn)紅色或者粉色[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法也可成為GBS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有著高檢出率和高特異度。但PCR的方法不能用作后續(xù)培養(yǎng)，而顯色培養(yǎng)不僅可做初步培養(yǎng)和鑒定，還可做后續(xù)的藥敏實(shí)驗(yàn)，故在產(chǎn)前篩查GBS時(shí)聯(lián)合應(yīng)用這兩種方法，可提高檢測率并可為臨床用藥提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)GBS對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率也在逐年上升，GBS對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥率分別為48.2%和37.9%，與美國研究報(bào)道的紅霉素和克林霉素耐藥率（分別為50.7%和38.4%）基本一致[5]。因此，孕晚期的孕產(chǎn)婦感染GBS后首選抗生素為青霉素，而青霉素過敏的患者可選用頭孢類藥物，萬古霉素有肝腎毒性慎用，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性較高一般不建議使用。58 株GBS菌株中的血清分型中Ⅲ型為最常見的血清型，Ⅲ型血清型GBS菌株會(huì)釋放大量外毒素和溶組織酶，這與國內(nèi)外研究結(jié)果相似[6]。GBS菌株的主要毒力因子為莢膜多糖，也是多價(jià)疫苗制備的基礎(chǔ)。因此對(duì)孕婦接種多價(jià)疫苗能有效預(yù)防新生兒感染GBS，從而減少GBS定植及母嬰感染概率。

綜上所述，隨著我國二胎政策的開放，GBS對(duì)母嬰帶來的危害也越來越嚴(yán)重，我國也應(yīng)更為廣泛地開展GBS篩檢，聯(lián)合使用顯色培養(yǎng)法和PCR法可顯著提高陽性率，并可進(jìn)行后續(xù)的藥敏實(shí)驗(yàn)和血清分型，為臨床合理使用抗生素提供重要依據(jù)，并根據(jù)血清分型制造有效疫苗。