E2F1與LGR5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義研究

韓 影，程 薇，刁文卓

（吉林省吉林市中心醫(yī)院1.病理科；2.神經(jīng)外科，吉林 吉林 132011）

結(jié)直腸癌是消化道內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)隨著生活水平的提高及不健康的飲食習(xí)慣，其發(fā)病率也逐漸攀升，其危害非常大。資料顯示，該病在我國(guó)境內(nèi)呈現(xiàn)出同比國(guó)際水平每年3%增速更高的漲幅，甚至可達(dá)5%，新發(fā)病例可高達(dá)40萬(wàn)/年。臨床中，對(duì)于處于同樣年齡段、分期，甚至性別均相同的病例，經(jīng)同樣藥物采用，所獲療效具較大差異性。鑒于此，基于同病異治理念的個(gè)體化靶向藥物治療，于患者及醫(yī)生均為佳選。

E2F1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期重要的影響因子之一，同時(shí)參與細(xì)胞的代謝、增殖及凋亡，是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵中心環(huán)節(jié)，可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)腫瘤的治療產(chǎn)生重要的影響[1]。LGR5在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物中非常有影響力的一個(gè)標(biāo)記物，特別是在結(jié)直腸癌中與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2016～2019年間手術(shù)及內(nèi)鏡活檢的石蠟包埋標(biāo)本200例，其中結(jié)直腸癌患者80例，腺瘤患者120例，所有病例均按照消化系統(tǒng)WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，結(jié)直腸癌患者高分化25人、中分化30人、低分化25人進(jìn)行分組，腺瘤患者低級(jí)別60人，高級(jí)別60人，隨機(jī)自腫瘤患者中采集20人癌旁正常組織進(jìn)行檢測(cè)，并納入對(duì)照組。納入試驗(yàn)者在術(shù)前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司所予提供的鼠抗人E2F1單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)有限公司所予提供的DAB試劑、SP染色試劑盒，LGR5鼠抗人多克隆抗體。

1.2.2 主要儀器

免疫組化配套儀器，石蠟切片機(jī)，電熱恒溫干燥箱，光學(xué)顯微鏡等。

1.2.3 免疫組化染色

針對(duì)所有病理切片進(jìn)行連續(xù)切片，厚度保持在2.5 μm，從中擇取一組，遵HE染色程序行標(biāo)準(zhǔn)染色，經(jīng)SP免疫組化法完成指標(biāo)E2F1、LGR5的檢測(cè)工作。

1.2.4 結(jié)果判定

基于半定量雙盲法，結(jié)合顯微鏡下所觀測(cè)到的免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞染色情況予以結(jié)果評(píng)價(jià)，一抗E2F1抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)判斷依據(jù)為細(xì)胞核呈現(xiàn)出棕黃色、棕褐色特征，LGR5抗體陽(yáng)性反應(yīng)判斷依據(jù)為細(xì)胞膜與細(xì)胞漿經(jīng)觀測(cè)均有棕黃色顆粒呈現(xiàn)，陰性對(duì)照為PBS代替一抗，針對(duì)每張切片均予以5個(gè)高倍視野隨機(jī)觀察，每個(gè)視野內(nèi)有200個(gè)腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)達(dá)50%及以上判定強(qiáng)陽(yáng)性診斷（+++），介于49%～25%判定陽(yáng)性（++），介于25%～5%范圍評(píng)定弱陽(yáng)性（+），而低于5%即為陰性判定（—）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)研究所獲數(shù)據(jù)倶以全新數(shù)據(jù)模型構(gòu)建，予以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（MEAN±SE）表示，并經(jīng)Graph Pad Instat 5.0完善統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較實(shí)施單因素方差分析，兩組間比較實(shí)施Student’st檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05呈現(xiàn)，示意差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

研究表明E2F1抗體陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞核著色，我們的研究結(jié)果表明，正常結(jié)直腸粘膜組織和結(jié)直腸腺瘤中陽(yáng)性表達(dá)較明顯，在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)（P＜0.05），而腫瘤組織中高、中、低分化程度之間則沒(méi)有明顯的顯著差異。說(shuō)明E2F1抗體的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 E2F1在結(jié)直腸癌及腺瘤中的表達(dá)

3 討 論

社會(huì)經(jīng)濟(jì)、科技以及醫(yī)療水平的高速發(fā)展與大幅進(jìn)步，使得近年臨床所予結(jié)直腸癌可實(shí)施的治療方案與手段呈現(xiàn)突飛猛進(jìn)的發(fā)展態(tài)勢(shì)，但并不與之呈相應(yīng)發(fā)展的民眾非健康生活方式，如飲食方式及飲食習(xí)慣等諸多問(wèn)題的出現(xiàn)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，且越來(lái)越年輕化。并且結(jié)直腸癌患者約占所有腸癌的90%左右，甚至占比更多，所以臨床醫(yī)生更迫切的需要尋找有效的診斷方法和治療手段，從而延長(zhǎng)患者生命并提高其生活質(zhì)量[3]。

（1）E2F1是Helin于1992年最先篩選出來(lái)的，也是轉(zhuǎn)錄因子E2F家族8個(gè)家族成員之一，E2F1作為轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，但是高表達(dá)的E2F1的也同樣能誘導(dǎo)諸多類型的細(xì)胞凋亡。在一些腫瘤如乳腺癌、肺癌等腫瘤中，E2F1是促進(jìn)細(xì)胞癌變的。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)正常結(jié)直腸粘膜的E2F1表達(dá)明顯，在腺瘤中表達(dá)有所下降，特別是低級(jí)別瘤變的組織中，而癌組織中表達(dá)明顯減少，這就說(shuō)明在結(jié)直腸癌患者中，E2F1起到一個(gè)腫瘤抑制的作用[4]。

（2）LGR5廣泛分布在人體多種器官，是G蛋白偶聯(lián)激素受體家族成員之一，也是一種獨(dú)立的G蛋白偶聯(lián)受體分子，亦被稱作G蛋白偶聯(lián)受體49（GPR49）。許多國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)LGR5在多種腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)直腸癌，肝細(xì)胞癌，卵巢癌，以及皮膚基底細(xì)胞癌等[5]。新近有研究表明LGR5在結(jié)直腸系膜隱窩的基底部高表達(dá)，提示此處可能為干細(xì)胞聚集的位置。也有文獻(xiàn)顯示在毛囊干細(xì)胞LGR5也會(huì)高表達(dá)，因此，我們推測(cè)LGR5在干細(xì)胞中可能起到重要作用。

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，可以有多種因素參與，E2F1、LGR5即為與其呈密切相關(guān)的因子，檢測(cè)所得數(shù)據(jù)顯示，前者與腫瘤惡性程度為正向相關(guān)關(guān)系，后者則為負(fù)相關(guān)。此外，本研究結(jié)果示，E2F1、LGR5在腫瘤發(fā)生中呈現(xiàn)出相互抑制特性。在臨床實(shí)踐中，E2F1、LGR5可視為結(jié)直腸癌檢測(cè)與診斷的突出且重要標(biāo)志物，并經(jīng)結(jié)合其他臨床參數(shù)，為治療方案制定與調(diào)整提供方向，且可評(píng)價(jià)預(yù)后[6]。采取有效方法實(shí)現(xiàn)對(duì)此兩種指標(biāo)表達(dá)水平的控制，或可成為結(jié)直腸癌臨床有效治療的新思路與方向。