促甲狀腺激素受體調(diào)控動(dòng)物季節(jié)性繁殖的研究進(jìn)展

夏 青 張仁森 李華振 王鳳艷 王翔宇 魏彩虹 賀小云 儲(chǔ)明星 狄 冉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

最初，促甲狀腺激素受體(Thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)在狗甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)，且在很長(zhǎng)一段時(shí)間里研究者們認(rèn)為T(mén)SHR基因只在動(dòng)物甲狀腺組織中表達(dá)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在動(dòng)物多個(gè)組織廣泛表達(dá)，并且甲狀腺和胸腺TSHR主要參與人類(lèi)格雷夫斯病(Graves’ disease, GD)發(fā)病機(jī)制調(diào)控[1-3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)下丘腦TSHR基因與動(dòng)物季節(jié)性繁殖行為具有較強(qiáng)的相關(guān)性[4-10]。下丘腦TSHR與促甲狀腺激素β亞基(Thyrotrophin β subunit, TSHβ)結(jié)合間接刺激甲狀腺激素(Thyroid hormone，TH)分泌，刺激下丘腦-垂體-性腺軸，以此調(diào)控季節(jié)性繁殖活動(dòng)[11]。卵巢TSHR還可調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞增殖[12]。因此，TSHR是動(dòng)物季節(jié)性繁殖的重要調(diào)控基因之一。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在綿羊中受到強(qiáng)烈選擇。因此，本文就TSHR的基本特征尤其是它對(duì)動(dòng)物季節(jié)性繁殖和卵巢功能的調(diào)控最新研究情況進(jìn)行闡述，為更好更深入的研究TSHR基因提供理論基礎(chǔ)。

1 TSHR的基本特征

1.1 TSHR基因及其表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)

TSHR基因及其編碼的蛋白在動(dòng)物中具有高度保守性。不同動(dòng)物TSHR基因位于不同染色體。例如綿羊位于7號(hào)染色體，雞位于5號(hào)染色體，人位于14號(hào)染色體，但絕大部分物種TSHR基因具有10個(gè)外顯子[8,13-14]。哺乳動(dòng)物(人、綿羊和大鼠)及非哺乳動(dòng)物(鵝、雞)TSHR基因均編碼約760個(gè)氨基酸的跨膜蛋白。TSHR蛋白屬于糖蛋白激素受體亞家族[6,15-16]，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，膜外結(jié)構(gòu)與膜內(nèi)結(jié)構(gòu)各自形成3個(gè)環(huán)，分為膜外、跨膜和膜內(nèi)區(qū)3個(gè)部分。TSHR胞外區(qū)主要由11個(gè)亮氨酸富集重復(fù)序列(Leucinerich repeat，LRRs)組成[17]。胞外區(qū)結(jié)構(gòu)有多個(gè)TSH結(jié)合位點(diǎn)，也包含了TSHR自身抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)[18]。TSHR的主要功能是與TSH結(jié)合，活化G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-cAMP和磷脂酶信號(hào)系統(tǒng)，激活G蛋白耦聯(lián)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)甲狀腺激素的合成、分泌和甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，是脊椎動(dòng)物垂體-甲狀腺軸的重要組成部分[19]。

1.2 TSHR在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)

TSHR基因最初從犬甲狀腺中克隆得到[20]。起初，研究者認(rèn)為T(mén)SHR僅在甲狀腺中表達(dá)，隨著研究不斷深入，在越來(lái)越多非甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)TSHR表達(dá)。例如，在小鼠眼眶后組織、下丘腦、垂體、淋巴細(xì)胞、棕色脂肪組織和紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TSHR存在[21]。人垂體前葉細(xì)胞、十二指腸成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有TSHR的表達(dá)[22]。動(dòng)物腦部TSHR的表達(dá)主要集中在下丘腦室管膜細(xì)胞(Ependymal cell, EC)和垂體結(jié)節(jié)部(Pars tuberalis, PT)區(qū)域[23]。Hazlerigg等[24]發(fā)現(xiàn)綿羊下丘腦正中隆起、室管膜室旁核、第三腦室、垂體、子宮和卵巢等組織均有TSHR表達(dá)。

對(duì)歐洲黑鱸的研究顯示，TSHR表達(dá)在黑鱸卵子和精子復(fù)生過(guò)程中呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化，TSHR參與雌性黑鱸卵黃生成以及調(diào)節(jié)配子成熟和排卵；對(duì)雄性黑鱸而言，TSHR可能涉及早期性腺發(fā)育的調(diào)節(jié)以及配子成熟和排精過(guò)程[25]。另外，哺乳動(dòng)物卵巢中也存在TSHR的表達(dá)，這種TSHR在卵巢上的表達(dá)可能與調(diào)節(jié)卵巢的功能有關(guān)。例如，雌性兔生殖器官中廣泛存在TSHR[26-27]。牛成熟黃體中存在TSHR蛋白，推測(cè)它參與孕激素合成的局部調(diào)節(jié)[28]。TSHR在大鼠卵巢中也發(fā)揮作用，且大鼠顆粒細(xì)胞TSHR存在高表達(dá)[29]。人TSHR在卵巢表皮以及原始、初級(jí)和次級(jí)卵泡中高表達(dá)，用TSH刺激顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)2 h發(fā)現(xiàn)cAMP濃度顯著增加，表明cAMP濃度受TSHR激活調(diào)控。這些數(shù)據(jù)表明TSHR可能對(duì)卵巢有調(diào)節(jié)功能，TSHR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)可能導(dǎo)致卵巢腫瘤發(fā)生[12,30]。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)TSHR在各種硬骨魚(yú)性腺中發(fā)揮作用[25,31]。這些數(shù)據(jù)表明TSHR對(duì)卵巢發(fā)育和動(dòng)物的繁殖有調(diào)節(jié)功能。

2 TSHR對(duì)卵巢功能的調(diào)控

目前，關(guān)于TSHR基因?qū)β殉沧饔脵C(jī)制的研究多集中在大鼠和人上。大鼠垂體分泌的促性腺激素(促黃體素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH))作用于卵巢，LH和FSH可驅(qū)動(dòng)cAMP級(jí)聯(lián)反應(yīng)上調(diào)TSHR表達(dá)，卵巢分泌高濃度的雌二醇(β-Estradiol，E2)抑制TSHR表達(dá)[28]。大鼠卵母細(xì)胞分泌甲狀腺刺激素(Thyrostimulin)作用于卵泡顆粒細(xì)胞，卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)的TSHR接受甲狀腺刺激蛋白信號(hào)，并與相關(guān)Gα蛋白(例如Gαs)相互作用，刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)開(kāi)啟cAMP依賴性途徑。研究發(fā)現(xiàn)上述途徑在人卵巢通過(guò)復(fù)雜的串聯(lián)通路，激活環(huán)狀A(yù)MP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Cyclic AMP-responsive element binding protein, CREBP)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase,AKT)通路，導(dǎo)致上述3種蛋白質(zhì)磷酸化水平增加[12]。表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制劑可有效消除AKT和ERK的磷酸化，并促進(jìn)甲狀腺刺激蛋白引起的細(xì)胞增殖，提示上述通路對(duì)顆粒細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。cAMP和蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)結(jié)合激活PKA，可刺激編碼P450芳香化酶和LHR轉(zhuǎn)錄，同時(shí)激活有絲分裂和卵泡液形成，使顆粒細(xì)胞中LHR和FSHR表達(dá)增加[12, 29]。

在兔卵巢表面上皮以及原始、初級(jí)和次級(jí)卵母細(xì)胞中觀察到了TSHR、TRα1和TRβ1強(qiáng)免疫染色，而次級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞中染色最弱。竇狀卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)TSHR、TRα1和TRβ1蛋白[32-33]。Wakim等[34]發(fā)現(xiàn)人黃素化顆粒細(xì)胞含有高親和力的甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)。卵巢外組織分泌的甲狀腺激素可作用于卵巢表面及顆粒細(xì)胞的甲狀腺激素受體，參與卵巢表面上皮的激素調(diào)節(jié)。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)人成熟卵母細(xì)胞含有TRα和TRβ，卵泡液中存在DIO2、DIO3、T3和T4。這表明卵巢中存在DIO2與DIO3相互轉(zhuǎn)化并刺激T3和T4相互轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制，同時(shí)T3可能直接作用于卵母細(xì)胞[33-36]。綜上所述，TSHR對(duì)卵巢調(diào)控機(jī)制如圖1所示。

圖1 TSHR對(duì)卵巢功能的調(diào)控[12,27]

3 TSHR對(duì)動(dòng)物季節(jié)性繁殖的調(diào)控

3.1 TSHR對(duì)綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控

下丘腦的TSHR參與調(diào)節(jié)鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖[37-38]。下丘腦室管膜細(xì)胞(Ependymal cell, EC)連通垂體門(mén)脈系統(tǒng)和第三腦室腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)，與下丘腦GnRH神經(jīng)元形成突觸連接。CSF中存在大量褪黑素(Melatonin，MT)，其濃度隨光周期而變化，TSHR可能通過(guò)感知MEL濃度變化，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)下游GnRH分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物季節(jié)性繁殖活動(dòng)[39]。Kijas等[4]使用綿羊SNP50芯片對(duì)世界各地74個(gè)品種2 819只綿羊進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)與生長(zhǎng)和繁殖有關(guān)的基因TSHR受到選擇。Fariello等[5]對(duì)Kijas等研究者獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，推測(cè)綿羊馴化歷史進(jìn)程中TSHR基因突變可能導(dǎo)致綿羊由季節(jié)性繁殖向常年繁殖轉(zhuǎn)變。同時(shí)國(guó)內(nèi)的許多研究結(jié)果均提示TSHR基因與綿羊季節(jié)性繁殖性狀具有較強(qiáng)的相關(guān)性[6-10]。

其中TSHR參與綿羊的詳細(xì)季節(jié)性繁殖機(jī)制如下：外界長(zhǎng)光照信號(hào)經(jīng)過(guò)綿羊腦部一系列轉(zhuǎn)化，刺激PT內(nèi)眼缺失基因3(Eyes absent 3,EYA3)表達(dá)變化，EYA3可與正弦相關(guān)同源盒1(Sine oculis-related homeobox 1, Six1)、促甲狀腺胚胎因子(Thyrotroph embryonic factor, Tef)及肝白血病因子(Hepatic leukemia factor, HLF)共同組成復(fù)合體與TSHβ 啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)PT內(nèi)TSHβ的表達(dá)[11]。TSHβ與下丘腦TSHR結(jié)合[40]，促進(jìn)第二信使環(huán)狀單磷酸腺苷(Cyclic AMP, cAMP)表達(dá)，這種正反饋途徑進(jìn)一步增加PT內(nèi)TSHβ表達(dá)[41-42]。Ono等[43]發(fā)現(xiàn)TSHR敲除(TSHR-KO)小鼠與正常小鼠相比PT內(nèi)TSHβ表達(dá)水平降低，暗示TSHR可能通過(guò)正反饋回路刺激PT內(nèi)TSHβ表達(dá)。綿羊TSHR與TSHβ結(jié)合刺激EC內(nèi)DIO2表達(dá)[3,44]，進(jìn)而刺激三碘甲狀腺原氨酸(Triodothyronine, T3)與四碘甲狀腺原氨酸(Tetraiodothyronine, T4)相互轉(zhuǎn)化，高濃度的T3抑制性腺軸的活性，此時(shí)綿羊進(jìn)入休情狀態(tài)[45-46]。TSHR參與綿羊的季節(jié)性繁殖機(jī)制圖見(jiàn)圖2。

圖2 TSHR調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖機(jī)制

3.2 TSHR對(duì)禽類(lèi)季節(jié)性繁殖的調(diào)控

鳥(niǎo)類(lèi)與哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖的分子機(jī)制雖有不同之處，但在涉及TSH參與的季節(jié)性繁殖通路上是保守的：TSHR與TSHβ相互作用間接調(diào)控T3濃度，T3作用于性腺軸調(diào)節(jié)動(dòng)物發(fā)情性狀[47]。

TSHR突變與家畜季節(jié)性繁殖有關(guān)，也深刻影響雞的馴化特性[48]。TSHR突變可能通過(guò)改變血漿中甲狀腺激素水平影響雞的馴化特性，因此在家雞進(jìn)化過(guò)程中起重要作用[49-50]。有研究者通過(guò)對(duì)8個(gè)品種家雞和野生紅色原雞的全基因組重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在雞馴化過(guò)程中受到選擇，并推測(cè)TSHR基因突變可能與雞季節(jié)性繁殖相關(guān)[49,51]。隨后，Karlsson等[41]針對(duì)TSHR基因使用紅色原雞(RJF-w/w)與白來(lái)航雞(WL-d/d)作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)光照改變使d/d型母雞TH水平發(fā)生變化，導(dǎo)致與w/w型母雞相比，產(chǎn)蛋時(shí)間提早，卵巢更活躍。并且發(fā)現(xiàn)短光照下公雞TSHR、TSHβ和DIO3的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致睪丸縮小。揭示TSHR突變調(diào)控了雞的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。以上結(jié)果均表明TSHR基因在禽類(lèi)季節(jié)性繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。且TSHR基因調(diào)控禽類(lèi)季節(jié)性繁殖機(jī)制與哺乳動(dòng)物相似，長(zhǎng)光照刺激禽類(lèi)深層腦感光細(xì)胞[52-53]，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，傳遞至PT區(qū)域，刺激PT表達(dá)TSHβ。TSHβ與下丘腦的TSHR結(jié)合誘導(dǎo)DIO2表達(dá)，DIO2促使T4轉(zhuǎn)換為T(mén)3[38,53-54]。高濃度的T3導(dǎo)致LH和FSH的分泌增加，進(jìn)而促進(jìn)性腺生長(zhǎng)[55]。

3.3 TSHR多態(tài)性與季節(jié)性繁殖的關(guān)系

目前，國(guó)外內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)綿羊TSHR基因突變位點(diǎn)與季節(jié)性繁殖相關(guān)。竇立靜等[6]在綿羊TSHR基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)c.31A>G錯(cuò)義突變位點(diǎn)，分析表明該位點(diǎn)在不同繁殖特性(季節(jié)性繁殖和常年繁殖)綿羊群體的基因型和等位基因頻率有明顯不同的分布趨勢(shì)，G等位基因與綿羊常年繁殖性狀具有顯著的相關(guān)性。該突變可能導(dǎo)致TSHR構(gòu)象發(fā)生變化，使其與TSH的結(jié)合能力改變，進(jìn)而影響繁殖機(jī)制下游，最終調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。Rubin等[51]深入研究發(fā)現(xiàn)雞TSHR基因Gly558Arg位點(diǎn)是一個(gè)重要的錯(cuò)義突變，位于TSHR第4跨膜結(jié)構(gòu)域與胞外loop交界處；Gly突變?yōu)锳rg導(dǎo)致氨基酸由跨膜區(qū)移到胞外區(qū)，從而影響配體的結(jié)合。這個(gè)突變大約在1 100年前受到高強(qiáng)度選擇，在現(xiàn)代雞種中它幾乎被固定為Arg[41,56]。Karlsson等[41,49]通過(guò)關(guān)聯(lián)分析證明了Gly558Arg表型效應(yīng)。Arg型比Gly型雞產(chǎn)蛋性能更好、孵化期更短、神經(jīng)敏感性和好斗性更低。軒俊麗等[8]發(fā)現(xiàn)綿羊TSHR基因外顯子SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性在烏珠穆沁羊和湖羊群體中存在極顯著差異，SNP3、SNP4和 SNP5位點(diǎn)的改變均導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致其表達(dá)和成熟異常，進(jìn)而與繁殖性狀變異相關(guān)。寸靜宇等[9]和夏青等[10]檢測(cè)了常年繁殖綿羊和季節(jié)性繁殖綿羊TSHR基因的共5個(gè)SNP位點(diǎn)，這5個(gè)位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年繁殖綿羊品種和季節(jié)性繁殖綿羊品種間差異均達(dá)到顯著水平，表明TSHR基因及多態(tài)性與綿羊季節(jié)性繁殖性狀具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

4 結(jié)束語(yǔ)

綜上可以看出，TSHR基因的研究已取得一定進(jìn)展，TSHR基因結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)特性已基本明確。并且卵巢TSHR對(duì)動(dòng)物卵巢功能調(diào)控以及下丘腦TSHR對(duì)綿羊及禽類(lèi)季節(jié)性繁殖調(diào)控分子機(jī)制已經(jīng)初步清晰。從現(xiàn)有的研究可以看出TSHR對(duì)動(dòng)物季節(jié)性繁殖至關(guān)重要，相信隨著進(jìn)一步對(duì)TSHR在哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖調(diào)控中作用機(jī)制的研究，必將會(huì)解決綿羊季節(jié)性繁殖中存在的疑難問(wèn)題，大大提高養(yǎng)羊效率。