內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤真菌的多樣性分析

馬 強(qiáng),夏冬雙,武志華,王雪寒,任興波,丁一秀,劉惠榮

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018)

真菌是土壤微生物的主要成員之一,它可以降解土壤中復(fù)雜組分,部分真菌在提高植物抗逆性、維持植物正常生長(zhǎng)方面發(fā)揮巨大作用[1],對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生重要影響。因此研究土壤真菌的多樣性對(duì)于土壤環(huán)境十分重要。目前土壤真菌僅被分離出很小一部分,從真菌對(duì)人類生產(chǎn)生活的重要程度來(lái)看,發(fā)現(xiàn)更多有利于人類的真菌是十分有必要的。

內(nèi)蒙古西部地區(qū)主要有鄂爾多斯、烏海、包頭、巴彥淖爾和阿拉善,是中國(guó)重要的農(nóng)牧業(yè)產(chǎn)區(qū)[2]。由于該地區(qū)有荒漠、戈壁、草原、山地等不同地形,且氣候類型為溫帶大陸性季風(fēng)氣候,較為干旱缺水,再加上一些人為破壞,導(dǎo)致該地區(qū)水土流失,荒漠化程度高[3],如鄂爾多斯與阿拉善等地荒漠化嚴(yán)重,其土壤類型主要為灰棕漠土和風(fēng)沙土,而西部其余三地主要為棕鈣土。內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤類型復(fù)雜多樣,有機(jī)質(zhì)的含量、pH、土壤利用方式、植物種類的不同,都會(huì)對(duì)真菌的分布產(chǎn)生不同程度的影響[4]。

目前各個(gè)領(lǐng)域針對(duì)微生物菌群多樣性的分析方法主要分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法兩種。培養(yǎng)法由于條件限制只能分離鑒定出少數(shù)微生物；而非培養(yǎng)法則是通過(guò)提取所有樣本的總DNA,通過(guò)PCR-DGGE擴(kuò)增遺傳區(qū)域后,可全面分析樣品中微生物菌群的多樣性。非培養(yǎng)法的主要研究方法有變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析等[5]。聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳 (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)[6-7]是微生物群落分析中最為常用的一種方法,具有快速、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),在各個(gè)領(lǐng)域中均被頻繁使用,如，荒漠、山丘等土壤微生物多樣性研究?，F(xiàn)利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)的土壤真菌進(jìn)行多樣性分析,為該地區(qū)土壤真菌多樣性研究及完善做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采集內(nèi)蒙古西部地區(qū)不同土壤類型得土壤樣品,并根據(jù)不同土壤類型的不同利用方式進(jìn)行土樣的采集,在內(nèi)蒙古西部地區(qū)共采集到的170份土樣,置于-80 ℃冰箱備用。土壤樣品信息如表1所示。

表1 土壤樣品信息Table 1 Information of soil samples

1.1.2 PCR引物

所用的引物參照呂新等[8]的研究選用真菌 18S rRNA 基因片段PCR擴(kuò)增引物,通過(guò)生工生物工程(上海)股份有限公司合成,如表2所示。

表2 本文所用的引物Table 2 The primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA提取

將李靖宇等[9]與Leff等[10]采用的土壤DNA的提取方法相結(jié)合優(yōu)化之后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以提高DNA的產(chǎn)量。

1.2.2 PCR反應(yīng)條件

采用50 μL反應(yīng)體系:10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物各0.4 μL、ExTaq 0.4 μL、模板1 μL、加無(wú)菌雙蒸水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 2 min；95 ℃ 50 s、65～55 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s、10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃)；94 ℃ 35 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 s,25個(gè)循環(huán)。

1.2.3 DGGE方法

采用 Bio-Rad 電泳系統(tǒng)，變性劑梯度為20%～40%的8%聚丙烯酰胺凝膠。上樣后120 V恒壓 5 min 后,再75 V、150 W恒壓14 h。染時(shí)用硝酸銀染[11]15 min后再洗脫10 min。洗脫后拍照,用Quantity One 4.6.2分析。由于土壤樣品眾多,采集范圍較廣,提取到的真菌群落的基因型差異較大,可分別用香農(nóng)指數(shù)H′、豐富度S、均勻度Eh等來(lái)進(jìn)行比較,計(jì)算公式為

(1)

Eh=H′/Hmax=H′/InS

(2)

R=S

(3)

式中：S為某一個(gè)樣品中(即每個(gè)泳道)所有條帶的和；Pi為每個(gè)泳道中屬于第i種的個(gè)體比例,如總的樣品數(shù)為N,則第i種個(gè)體數(shù)為ni,那么Pi=ni/N。之后將所需的目的條帶進(jìn)行切膠回收后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序。

1.2.4 序列測(cè)定及分析

在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中,對(duì)本研究得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析,使用Mega 5.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌多樣性

2.1.1 真菌18S rRNA

由于引物前的GC序列重復(fù)度高,因此在對(duì)真菌18S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)難度較大,通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn),找出真菌PCR的最適反應(yīng)條件,得到片段大小為350 bp的清晰條帶,如圖1所示。

M為DNA Marker；1～9為樣品BT13、ERDS15、BT4、BM29、BM30、BM25、ERDS32、ERDS4、AL31總DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 真菌18S rRNA 基因片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Fig.1 PCR products of the fragment of 18S rRNA gene of fungi

2.1.2 PCR產(chǎn)物的DGGE分析

用DGGE電泳檢測(cè)PCR純化后的產(chǎn)物。如圖2所示,用Quantity One 4.6.2 進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,不同泳道中的條帶與數(shù)目差別較大,優(yōu)勢(shì)條帶較少。

1#～12#樣品為BT13、ERDS13、BM33、BM30、BM22、ERDS31、ERDS4、AL32、ERDS30、ERDS29、ERDS6、ERDS32的PCR-DGGE結(jié)果圖2 部分土樣真菌18S rRNA 基因片段PCR產(chǎn)物DGGE圖譜Fig.2 DGGE image of PCR products of 18S rRNA gene of fungi of partial soil samples

2.2 土壤真菌多樣性分析

用Quantity one軟件來(lái)分析圖2,得到條帶分布及強(qiáng)度示意圖(圖3)。由圖3可知，不同土壤樣品中的真菌DGGE條帶分布有著明顯區(qū)別。在利用方式均為耕地的2#、6#、10#、11#泳道的土樣中,2#為風(fēng)沙土,6#、10#為灰鈣土,11#為栗鈣土,從泳道的條帶多少來(lái)看,2#、11#泳道的條帶數(shù)較多,而6#、10# 泳道的條帶數(shù)則相對(duì)較少,由此可知,在內(nèi)蒙古西部地區(qū),相同利用方式的土壤中,不同土壤類型中真菌的多樣性差別較大。6#、9#、10#、12#均為灰鈣土,但它們的土壤利用方式不同,如6#、10#的土地利用方式為耕地、9#為林地、12#為草地,由圖3可知,6#、9#有11個(gè)條帶,10#有12個(gè)條帶,12#有30個(gè)條帶,9#的條帶大都分布在膠圖的中下部,而 6# 則分布在中部,9#的優(yōu)勢(shì)條帶也與6#明顯不同,且12#的優(yōu)勢(shì)條帶與6#、9#、10#的分布大部分不相同,它們的條帶數(shù)目與強(qiáng)度明顯不同,說(shuō)明土壤利用方式的不同對(duì)真菌的分布影響較大；在土壤類型及利用方式均相同的6#、10#土樣中,圖3顯示其條帶數(shù)及優(yōu)勢(shì)條帶基本相似,可見(jiàn)微生物類群也應(yīng)該相差不大；來(lái)自巴彥淖爾的3#土樣與來(lái)自阿拉善的8#土樣的土壤利用方式均為未利用的荒漠風(fēng)沙土,如圖3所示,它們的條帶數(shù)分別為13、7條,它們不光條帶數(shù)并不完全相同,且優(yōu)勢(shì)條帶也不一致,此外8#土樣優(yōu)勢(shì)條帶具有特異性,說(shuō)明真菌的分布除了受土壤類型及利用方式的影響外,還可能與其他地理環(huán)境條件有關(guān)。

圖3 部分土壤樣品真菌18S rRNA基因的PCR產(chǎn)物DGGE電子圖譜(與圖2對(duì)應(yīng))Fig.3 DGGE electron image of PCR products of fungal 18S rRNA gene of partial soil samples (Corresponding to Fig.2)

將真菌18S rRNA基因的DGGE圖譜標(biāo)準(zhǔn)化,各土壤類型中真菌的分布特點(diǎn)用香農(nóng)指數(shù)、豐富度、均勻度等多樣性指數(shù)來(lái)分析。香農(nóng)指數(shù)是微生物的多樣性指數(shù)[12],其數(shù)值越大多樣性越豐富；豐富度指一個(gè)群落結(jié)構(gòu)中的物種數(shù)目；均勻度指數(shù)越接近1,群落結(jié)構(gòu)組成越均勻[13]。表3所示為各土壤類型的香農(nóng)指數(shù)、豐富度、均勻度計(jì)算平均值,其中,棕鈣土的香農(nóng)指數(shù)、豐富度的平均值均為最高,草甸土香農(nóng)指數(shù)、豐富度的平均值均為最低,均勻度指數(shù)的平均值則不同,均勻度指數(shù)平均值最高的為灰色森林土,最低的為栗鈣土。由此可見(jiàn),不同土壤類型中的真菌數(shù)目差距較大,棕鈣土中的真菌數(shù)目最豐富,石質(zhì)土與栗鈣土的真菌數(shù)目相對(duì)較少,而草甸土的真菌數(shù)目最少,其他類型的土壤中真菌數(shù)目居中；所有土壤類型的均勻度指數(shù)均十分接近于1,可見(jiàn)在內(nèi)蒙古西部地區(qū)采集到的所有土壤樣品的結(jié)構(gòu)組成都比較均勻,真菌群落結(jié)構(gòu)受土壤類型的影響不明顯。

表3 不同土壤類型真菌多樣性指數(shù)Table 3 Fungal diversity index of different soil types

將實(shí)驗(yàn)用到的土壤樣品按照其不同的利用方式分為耕地土、林地土、草地土、未利用土地后,將不同利用類型土地的香農(nóng)指數(shù)、豐富度、均勻度等計(jì)算平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì),如表4所示。各利用類型土壤的香農(nóng)指數(shù)與豐富度的規(guī)律一致,其平均值由高到低為草地土>耕地土>林地土>未利用土壤,說(shuō)明耕地土與草地土的真菌物種數(shù)目要明顯高于林地土與未利用土壤,未利用土壤真菌物種數(shù)目最少。

表4 不同土壤利用類型真菌多樣性指數(shù)Table 4 Fungal diversity index of different utilization patterns of soils

2.3 土壤真菌多樣性與理化性質(zhì)的關(guān)系

武志華等[13]測(cè)定了不同類型土壤樣品的pH、含水量、有機(jī)質(zhì)等的含量,發(fā)現(xiàn)在土壤類型中,其理化性質(zhì)差異較大。在內(nèi)蒙古西部地區(qū)的土壤樣品中,中性土壤占27.06%,微堿性土壤占66.47%；在采集到的不同類型土壤樣品中,除含水量較高的栗褐土之外,內(nèi)蒙古西部地區(qū)大部分土壤類型的含水量較少；水解氮及有機(jī)質(zhì)在沼澤土中的含量最高,而其余土壤類型的水解氮含量均處于較低狀態(tài)；有機(jī)質(zhì)在大部分土壤類型中的含量較少,僅在灰褐土與草甸土的含量適中；沼澤土、栗褐土、鹽土、潮土、灰褐土的速效鉀含量適中,剩余土壤類型的速效鉀含量處于較低水平。

根據(jù)土壤樣品利用方式不同將各個(gè)地區(qū)土壤樣品的環(huán)境參數(shù)進(jìn)行分析,如表5所示。pH在不同利用方式的土壤中相差不大；含水量由高到低分別為耕地>林地>草地>未利用土壤；水解氮的含量由高到低分別為林地>耕地>草地>未利用土壤；速效鉀含量由高到低分別為草地>林地>耕地>未利用土壤,其中未利用土壤的水解氮、速效鉀含量明顯低于其他3種利用類型；未利用土壤的有機(jī)質(zhì)含量最低,林地的有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種利用方式,這可能是由于林地長(zhǎng)期以來(lái)的落葉積累、光照強(qiáng)度低等因素導(dǎo)致有腐殖質(zhì)含量高；耕地的有效磷含量最高,未利用土壤與草地的有效磷含量相差不大,林地的有效磷的含量明顯低于其他 3種土地利用類型。

表5 不同利用方式土壤環(huán)境參數(shù)的平均值Table 5 Average value of soil environmental parameters under different utilization methods

將本實(shí)驗(yàn)用到的所有土壤樣品的pH、含水量等環(huán)境參數(shù)與真菌香農(nóng)指數(shù)、豐富度用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表6所示。由表6可知,除pH、有機(jī)質(zhì)的含量與香農(nóng)指數(shù)和豐富度的相關(guān)性為負(fù)相關(guān)關(guān)系外,其余環(huán)境參數(shù)與香農(nóng)指數(shù)和豐富度均正相關(guān)。由表6可知，以上土壤環(huán)境參數(shù)指標(biāo)與真菌多樣性指數(shù)相關(guān)性可忽略不計(jì)。顯示只有pH會(huì)對(duì)真菌分布的均勻度有所影響,在中性偏微酸性的pH范圍內(nèi),pH越高,真菌分布越均勻。

表6 土壤理化性質(zhì)與真菌多樣性指數(shù)的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficient between soil environmental parameter and fungal diversity index

2.4 土壤真菌18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

因部分優(yōu)勢(shì)條帶回收后得到的DNA量無(wú)法滿足測(cè)序所需的最低要求,故測(cè)序結(jié)果并不完整。實(shí)驗(yàn)最后總共得到13個(gè)18S rRNA基因序列,從這13個(gè)序列中篩選出 9個(gè)同源性相對(duì)最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株,用ClustalX 2.0進(jìn)行分析比較后,用Mega5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,如圖4所示,在屬水平總共分為9個(gè)屬,包括Penicillium(青霉屬)、Aureobasidium(短柄霉屬)、Pyrenochata(棘殼菌屬)、Rhodocybella(紅蓋菇屬)、Vanderwaltozyma、Kazachstania、Cystofilobasidium、Saccharomyces(酵母菌屬),還有一株未被培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌。屬于Penicillium(青霉屬)的菌株最多,為3株；Pyrenochaeta(棘殼菌屬)有2株；Saccharomyces(酵母菌屬)有2株；有一株是未被培養(yǎng)的菌株。

圖4 土壤真菌18S rRNA-DGGE優(yōu)勢(shì)條帶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of soil fungal 18S rRNA-DGGE dominant bands

3 討論

目前已發(fā)表的關(guān)于內(nèi)蒙古地區(qū)土壤真菌的文章大多數(shù)為單一土壤類型的研究,如對(duì)荒漠土壤或部分林地土壤真菌的研究[14-17]。研究則是利用PCR-DGGE方法對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)的不同土壤類型中的土壤真菌多樣性進(jìn)行初步研究與分析,找到土壤類型及利用類型與真菌多樣性的關(guān)聯(lián),為日后該地區(qū)土壤真菌的開(kāi)發(fā)做好基礎(chǔ)。

在內(nèi)蒙古西部地區(qū),真菌的多樣性受土壤類型的影響較大,棕鈣土、石質(zhì)土、栗鈣土的香農(nóng)指數(shù)及豐富度相對(duì)較高,栗褐土、鹽土、草甸土則相對(duì)較低。棕鈣土在內(nèi)蒙古西部地區(qū)分布較廣,鈣積作用強(qiáng),表層有機(jī)質(zhì)含量較多,栗鈣土的腐殖層相對(duì)棕鈣土更厚,有機(jī)質(zhì)更多,相對(duì)肥沃,真菌資源較為豐富；栗褐土母質(zhì)特征明顯,土壤表層有機(jī)質(zhì)含量較低,多樣性指數(shù)較低；內(nèi)蒙古的草甸土有很大一部分是鹽堿草甸土,鹽分含量高,故對(duì)真菌多樣性有較大影響,導(dǎo)致真菌多樣性指數(shù)低。內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤真菌多樣性的差異,受地貌復(fù)雜、水資源短缺、沙漠化嚴(yán)重等眾多因素影響[18-20],可能導(dǎo)致結(jié)果差異較大。

研究發(fā)現(xiàn)在同一地區(qū)的相同類型的土壤中,土壤的利用方式對(duì)真菌的結(jié)構(gòu)及多樣性影響較大,此外,內(nèi)蒙古西部地區(qū)降雨量、溫度與地形等諸多因素都有很大的區(qū)別[21],可能導(dǎo)致不同地區(qū)的相同土壤類型的真菌結(jié)構(gòu)差異很大。如在鄂爾多斯同一地區(qū)的灰鈣土中耕地的微生物種類比草地的微生物種類少,耕地的真菌條帶明顯比草地少,如圖3所示,12#為草地灰鈣土,6#、10#為耕地灰鈣土,9#為林地灰鈣土,草地真菌的多樣性要與耕地與林地相比更為豐富。內(nèi)蒙古西部地區(qū)占地面積較大,土壤種類較多,再加上土壤的利用方式不同,另外,菌的多樣性受到各方面因素的制約,包括土壤的理化性質(zhì)、重金屬污染等[22]都是真菌多樣性變化的直接或間接因素。

實(shí)驗(yàn)最終得到兩個(gè)門(mén)Ascomycota(子囊菌門(mén))與Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén)),共9個(gè)屬的真菌優(yōu)勢(shì)條帶,分別為Penicillium(青霉屬)、Aureobasidium(短柄霉屬)、Pyrenochata(棘殼菌屬)、Rhodocybella(紅蓋菇屬)、Vanderwaltozyma、Kazachstania、Cystofilobasidium、Saccharomyces(酵母菌屬),還有一株未被培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌。屬于Penicillium(青霉屬)的菌株最多,為3株；Pyrenochaeta(棘殼菌屬)有2株；Saccharomyces(酵母菌屬)有2株；有一株是未被培養(yǎng)的菌株。真菌優(yōu)勢(shì)條帶基本都包括Ascomycota(子囊菌門(mén))與Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén)),以上基本與張星星[23]、李浩[24]、張善利[25]的研究基本保持一致。賈美清等[16]在研究?jī)?nèi)蒙古荒漠草原土壤真菌時(shí)共發(fā)現(xiàn)14個(gè)屬的真菌,其中青霉屬的真菌占可培養(yǎng)真菌數(shù)的48.76%,這與研究中分離出的青霉屬比例相似。

研究發(fā)現(xiàn)土樣的各項(xiàng)理化性質(zhì)指標(biāo),如含水量、pH與真菌的香農(nóng)指數(shù)、豐富度之間的相關(guān)性并不顯著。寧夏沙漠地區(qū)分離到 7屬 44 種,土壤真菌數(shù)量表現(xiàn)為天然荒漠草原>固沙地>流沙[26]；李玲[27]在北方草地土壤真菌的研究中發(fā)現(xiàn),土壤理化指標(biāo)與真菌多樣性無(wú)相關(guān)性,土壤真菌種系型豐富度與土壤含水量、有機(jī)碳含量、全氮含量及全磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；余潮等[28]研究發(fā)現(xiàn),除全磷含量以外,土壤理化指標(biāo)和真菌生物量都對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的變化有明顯影響,其中起決定作用的理化因子為含水量、總有機(jī)碳含量和土壤容重?？梢?jiàn),土壤部分理化指標(biāo)是影響土壤真菌多樣性的重要指標(biāo)。這與本文研究結(jié)果略有不符,可能是由于內(nèi)蒙古西部地區(qū)獨(dú)特的地理?xiàng)l件以及氣候因素等原導(dǎo)因素致影響真菌多樣性的原因較多,另本文研究發(fā)現(xiàn)土壤類型與其利用方式也會(huì)對(duì)土壤真菌的多樣性產(chǎn)生較大影響,而上述研究人員的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是建立在單一土壤利用類型上的。

4 結(jié)論

利用PCR-DGGE方法對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤中的真菌多樣性進(jìn)行了初步分析；發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古西部西區(qū)真菌資源較為豐富,其多樣性受土壤類型影響較大。優(yōu)勢(shì)菌群包括Ascomycota(子囊菌門(mén))與Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén))。

真菌是與人類生產(chǎn)生活息息相關(guān)的一類菌群,研究成果為今后該地區(qū)土壤環(huán)境的改善及真菌資源的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。