厭氧反硝化體系對磺胺嘧啶的共代謝降解特性

鄭杰蓉,汪素芳,趙曉嬋,李培瑞,董 靜,岳秀萍

(太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,太原 030024)

磺胺類藥物作為一種人工合成的抗生素,已廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療及養(yǎng)殖行業(yè),目前在制藥廢水、生活污水和地表水中經(jīng)?？梢詸z測出磺胺類抗生素殘留,它們會對人體健康造成一定影響,因此得到了人類社會越來越廣泛的關(guān)注[1-3]?；前粪奏?sulfadiazine,SDZ)是磺胺類藥物的代表,屬于較難生物降解的含氮雜環(huán)化合物,在進入自然水體后若不能得到有效降解,不僅能對水生生物和水體產(chǎn)生一定的影響,還會通過食物鏈富集作用或水循環(huán)進入人體,最終會威脅人類健康[4-5]。因此,為有效去除環(huán)境中的SDZ,對其降解技術(shù)及原理進行深入研究顯得尤為必要。生物處理技術(shù)由于其具有設(shè)備簡單、操作方便、二次污染小、運行成本低等特點，被廣泛應(yīng)用于污染物的去除。目前,與SDZ生物降解相關(guān)的研究主要是通過提純菌株來進行,然而由于某些純化菌株對SDZ的降解路徑比較單一,使得氮雜環(huán)部分積累較多,因此SDZ的礦化程度受限[6-7]。到目前為止,采用混合菌群來降解污水中SDZ的報道較少。Wang等[8]研究了雙室微生物燃料電池(microbial fuel cell,MFC)對SDZ的生物降解特性,結(jié)果表明不同功能的微生物菌群共同作用,不僅使反應(yīng)體系中SDZ得到更加徹底的降解,也有一定潛力去降低反應(yīng)體系的出水生物毒性,在實際工程應(yīng)用中具有良好的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 活性污泥的馴化

活性污泥取自晉中市某一污水處理廠(SBR工藝)濃縮池,反應(yīng)器為500 mL厭氧反應(yīng)器,構(gòu)型如圖1所示。活性污泥與礦物質(zhì)鹽溶液體積比為1∶10,總體積為300 mL。每升混合液中微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如下:SDZ,NaAc (200 mg),NaCl (0.5 g),微量元素(10 mL)[11],維生素 (0.01 mL),K2HPO4(0.02 g),KH2PO4(0.02 g),NaNO3(COD/N=5)。研究設(shè)單基質(zhì)組 (SDZ) 和共基質(zhì)組 (SDZ和NaAc) 兩組對照,每組對照各設(shè)置3個平行實驗。反應(yīng)器啟動后,進水SDZ濃度從10 mg/L逐步增加,梯度為10 mg/L,更換反應(yīng)液的周期為10 d。每個進水SDZ濃度持續(xù)3個周期。每個周期反應(yīng)液更換完成后,先驗證反應(yīng)器氣密性,之后連續(xù)充氮15 min使其保持嚴格的厭氧環(huán)境,最后將反應(yīng)器置于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

圖1 反應(yīng)器構(gòu)型Fig.1 Reactor configuration

1.2 分析方法

1.2.1 基本指標檢測

1.2.2 碳平衡試驗

為評價硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以乙酸鈉為共代謝基質(zhì)時SDZ的礦化程度,當反應(yīng)器中SDZ初始濃度為50 mg/L時,反應(yīng)液更換完成后在0 h和88 h分別取樣,用孔徑為0.45 μm的無機濾膜過濾水樣,通過TOC分析儀(TOC-V CPH,島津公司)測定總有機碳(total organic carbon,TOC)和無機碳(inorganic carbon,IC)濃度。此外,用元素分析儀測污泥中的生物量碳。在排氣口接200 mL氣袋收集反應(yīng)器中的氣體,用氣相色譜儀測定其中CO2和CH4的濃度。

1.2.3 SDZ中間產(chǎn)物的測定

甲酸水(0.5%) (A)為水相,乙腈(B)為有機相,采用UPLC-MS/MS[Waters UPLC(I-class)]對SDZ代謝產(chǎn)物的水樣進行分析。流動相比例梯度為0～4 min:A%∶B%=80∶20；5～7 min:A%∶B%=60∶40；8～9 min:A%∶B%=80∶20；流速:0.3 mL/min。PDA檢測采用200～360 nm波長連續(xù)掃描。MS/MS分析使用電噴霧電離(ESI+和ESI-)在50～500m/z的質(zhì)量掃描范圍內(nèi)進行。

1.2.4 微生物群落的測定

微生物馴化5個月后,取出反應(yīng)器底部的活性污泥通過高通量測序方法測定其中的微生物群落(上海凌恩)[12]。采用土壤DNA分離試劑盒提取樣品中DNA來擴增16S rRNA的V3-V4區(qū)域,515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTC-AATTCMTTTRAGTTT-3’)作為引物。最終采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析,并統(tǒng)計各樣本的群落組成。

1.2.5 出水生物毒性測定

為評價共代謝厭氧反硝化體系降解SDZ后的出水生物毒性,實驗以大腸桿菌為受試菌體,在SDZ初始濃度為50 mg/L時,對周期末反應(yīng)液進行了毒性檢測,步驟如下。

(1)將周期末反應(yīng)液在高速離心機中離心(8 000 r/min,20 min) 后,用直徑為0.22 μm的有機膜過濾,使用該反應(yīng)液配制LB培養(yǎng)基(實驗組)。

(2)用超純水配置LB培養(yǎng)基,并將其配置成一定濃度梯度的SDZ培養(yǎng)液,其中0 mg/L SDZ組為空白組,其余組為SDZ組。

(3)使用LB培養(yǎng)基將純化的大腸桿菌稀釋10倍,取100 μL加入上述空白組,SDZ組和實驗組,在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后,用酶標儀測其OD600。通過SPSS軟件對SDZ組和空白組OD600的顯著性差異進行分析(*P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 共代謝體系中SDZ的厭氧反硝化降解

反應(yīng)器啟動后,隨著微生物的馴化,共代謝厭氧反硝化體系對SDZ的降解效率逐漸提高。微生物馴化2個月時,SDZ初始濃度為20 mg/L,10 d內(nèi)反應(yīng)體系中微生物對SDZ的降解率為66.13%。微生物馴化3個月時,30 mg/L的SDZ在120 h內(nèi)降解率可達76.15%。第5個月SDZ初始濃度為50 mg/L時,88 h內(nèi)微生物對SDZ的降解率為97.36%,微生物對SDZ的降解效率有了很大提高。

為體現(xiàn)以SDZ和NaAc為底物時厭氧反硝化體系中微生物菌群對SDZ的降解優(yōu)勢,實驗對比了在厭氧反硝化體系中有無NaAc存在時微生物菌群對SDZ的降解效率。如圖2所示,SDZ初始濃度為50 mg/L時,在硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以NaAc為共代謝基質(zhì)時88 h內(nèi)微生物對SDZ的降解率為97.36%；無NaAc存在時88 h內(nèi)混合菌群對SDZ的降解率僅為57.02%。由此可見,在微生物馴化階段,NaAc會促進混合微生物菌群對SDZ的厭氧反硝化降解。本實驗在混合菌群厭氧反硝化體系中以NaAc作為額外的電子供體,一方面可使那些難以在SDZ體系中存活的微生物參與到目標電子受體的還原反應(yīng)中,加速微生物對SDZ的代謝[13],另一方面,NaAc作為共代謝基質(zhì)存在于硝酸鹽體系中時,可為微生物的生長提供能量,從而促進混合菌群對SDZ的降解[14]。

圖2 SDZ的去除效率Fig.2 The removal efficiency of SDZ

圖3 反應(yīng)器中 和變化Fig.3 The changes of and

2.2 碳平衡實驗

實驗檢測了以SDZ和NaAc為底物時,88 h內(nèi)硝酸鹽厭氧反硝化體系中的碳平衡情況,如表1所示。SDZ初始濃度為50 mg/L時,反應(yīng)液中的初始TOC濃度為116.3 mg/L,88 h后TOC為7.9 mg/L,降解率為93.21%,其中乙酸鈉所貢獻的TOC降解率為97.20%,SDZ所貢獻的TOC降解率為85.53%,高于相關(guān)研究中純種菌株對SDZ的礦化程度[16-17]。反應(yīng)液中約13%和33.4%的碳分別轉(zhuǎn)化為CH4和CO2,此時體系中仍有23.5 mg/L無機碳和5.6 mg/L有機碳,分別占反應(yīng)液中初始總碳的19.71%和4.7%。此外,生物量碳從15.32 mg/L提高到44.12 mg/L,生物量隨著TOC的減少而增加,可見反應(yīng)體系中SDZ和NaAc為微生物的生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)。

表1 碳平衡分析Table 1 Carbon balance analysis

2.3 SDZ降解路徑推測

圖4 SDZ降解路徑Fig.4 Proposed pathways

這4條代謝路徑主要包括SDZ水解,磺胺部分硫的還原,嘧啶部分C—N鍵的斷裂,氨基氧化等反應(yīng)。這一系列反應(yīng)由體系中不同功能的微生物菌群共同完成,從不同的反應(yīng)路徑對SDZ進行了生物降解,體系中SDZ得到更加徹底的去除。

2.4 與SDZ降解相關(guān)的功能菌群分析

反應(yīng)器內(nèi)活性污泥馴化5個月后,為測定共代謝厭氧反硝化反應(yīng)體系中與SDZ降解相關(guān)的功能菌群,對污泥中的微生物菌群進行了高通量分析。樣品包括原污泥樣品(空白組S1),實驗中以SDZ和NaAc為底物時經(jīng)過厭氧反硝化過程馴化后的污泥樣品(共基質(zhì)組S2),以SDZ為單一底物進行厭氧反硝化馴化后的污泥樣品(單基質(zhì)組S3)。如圖5所示,在高通量測序結(jié)果中,3種污泥樣品中的微生物群落表現(xiàn)出十分明顯的差異。S2中檢測出一些功能菌群,與S1和S3相比有明顯的優(yōu)勢,這些微生物主要包括厭氧反硝化菌,脫氮菌和脫硫菌等。

圖5 功能微生物在屬水平的相對豐度Fig.5 Relative abundance of functional bacteria at genus level

BacteroidetesVC2.1Bac22_norank(1.52%)是抗生素耐藥基因(ARG)的潛在宿主[19],本實驗中BacteroidetesVC2.1Bac22_norank在S2中占有優(yōu)勢,可推測這種微生物可在磺胺類抗生素廢水中大量繁殖。Ignavibacterium(22.70%)能以含硫化合物為電子供體達到去除體系中難降解污染物的目的,同時對一些抗生素具有耐藥性[20],因而可以推測這種微生物可以通過硫的代謝來降解反應(yīng)體系中的SDZ。研究發(fā)現(xiàn)Opitutus、Planctomicrobium、AKYG587、Thauera、Aquamicrobium和Azoarcus等微生物菌群均可參與反硝化過程,在脫氮的同時降解體系中的難降解有機物。Opitutus(0.23%)和Planctomicrobium(1.25%)可參與環(huán)境中的氮循環(huán),主要將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽來進行脫氮[21]。AKYG587(1.43%)可通過反硝化作用將含氮化合物轉(zhuǎn)化為氮氣和一氧化二氮[22]。Aquamicrobium(2.35%)可將含氮雜環(huán)裂解,釋放出單質(zhì)硫,使得反硝化體系中的硝酸鹽最終轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[23-24],從而促進磺胺類藥物的去除。Azoarcus(10.78%)是一種新型的反硝化菌,在厭氧條件下通過環(huán)裂解途徑降解各種芳香族化合物,其中包括一些有毒和難降解的化合物,在抗生素生物降解過程中起到很大的作用[25-26]。Rivibacter(5.02%)可降解復(fù)雜的有機化合物,諸如脂肪酸、多胺等,因而可以推測這種微生物對SDZ的去除也有一定潛力[27]。Thauera(31.02%)屬于反硝化菌的范疇,可通過不同的路徑進行脫氮,又與芳香化合物的降解相關(guān)[28-29],因而可在含有SDZ的污水中大量存在。

Anaerolinea(1.16%)和Bellilinea(0.64%)屬于Anaerolineaceae,研究表明,Anaerolineaceae與厭氧環(huán)境中芳烴、環(huán)烷芳烴、含氮硫化合物的降解相關(guān),因此可推測Anaerolineaceae對磺胺類藥物的降解也有一定的作用[30]。與此同時,在直鏈烷基苯磺酸鹽 (LAS)濃度很高的污水中,Bellilinea(0.63%)也很多[31],它可能與SDZ中間代謝產(chǎn)物的降解相關(guān)。Truepera(0.56%)可以吸收各種有機酸和氨基酸[32],對該反應(yīng)體系中的氨氮具有一定的去除效果,這與氨氮濃度在后期逐漸降低具有一定關(guān)系。由此可見,在混合菌群存在的共代謝硝酸鹽厭氧反硝化體系中,具有反硝化、脫硫、脫氮等不同生物功能的微生物菌群共同作用,有潛力使SDZ得到更為徹底的去除。

2.5 產(chǎn)物生物毒性

對空白組、SDZ組和實驗組對大腸桿菌的抑制程度進行評價。如圖6所示,對比了不同SDZ濃度和空白組,實驗組在第24 h時的OD600。

圖6 空白組、SDZ組、實驗組OD600對比Fig.6 OD600 of blank group,SDZ group and experimental group

當SDZ濃度大于或等于8 mg/L時,SDZ組與空白組的OD600有顯著性差異。此外,對空白組,實驗組和對照組3組實驗中大腸桿菌在24 h的OD600進行比較,結(jié)果表明,OD600的大小順序為實驗組>空白組>SDZ組。在本實驗中,SDZ組對大腸桿菌的生長有明顯的抑制作用。實驗組大腸桿菌的OD600高于空白組可能是由于周期末SDZ代謝產(chǎn)物中殘余的有機物及無機物為大腸桿菌的生長提供了營養(yǎng)物質(zhì),故反應(yīng)器出水中殘留的有機物無生物毒性。因而在硝酸鹽厭氧反硝化體系中,以NaAc為共代謝基質(zhì)時,混合菌群降解污水中SDZ后,其出水不會對環(huán)境造成二次污染。

3 結(jié)論

以NaAc為共代謝基質(zhì)時,硝酸鹽體系中混合菌群厭氧反硝化降解污水中SDZ主要性能表現(xiàn)如下。

(1)活性污泥馴化5個月后,反應(yīng)體系中微生物菌群對SDZ有明顯的去除效果。88 h內(nèi)SDZ (50 mg/L)的去除率可達97.36%,比單基質(zhì)體系高出40.34%,乙酸鈉作為額外的電子供體,加速了微生物菌群對SDZ的代謝；88 h內(nèi)SDZ所貢獻的TOC降解率為85.53%,礦化程度高于其他相關(guān)研究。

(2)該體系中SDZ生物降解主要有4種途徑,包括SDZ水解、磺胺部分硫的還原、嘧啶部分C—N鍵的斷裂，氨基氧化等反應(yīng)；降解SDZ的功能菌群以反硝化菌和脫硫菌為主(如Ignavibacterium、Azoarcus、Rivibacter等),共同促進SDZ的生物降解。