手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)2 型糖尿病小鼠術(shù)后認(rèn)知功能和腦葡萄糖代謝的影響

羅 鋼，崔永晨，曹 越，張俊峰

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海200233

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是麻醉手術(shù)后常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。術(shù)后認(rèn)知研究國(guó)際協(xié)作組最近建議將POCD 更名為圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND），指術(shù)前與術(shù)后12 個(gè)月內(nèi)發(fā)生的包括術(shù)后譫妄在內(nèi)的所有圍術(shù)期認(rèn)知功能改變[1]。因本實(shí)驗(yàn)僅研究術(shù)后出現(xiàn)的以學(xué)習(xí)記憶功能下降為主要表現(xiàn)的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，故仍采用POCD 這一術(shù)語(yǔ)。POCD 可導(dǎo)致患者長(zhǎng)期的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量，增加患者及社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和費(fèi)用[2-3]，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，每年有超過(guò)30%的65 歲以上老年人經(jīng)歷手術(shù)創(chuàng)傷，所以POCD 所帶來(lái)的健康問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將會(huì)逐年加重[4]，因此研究POCD 的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床和社會(huì)意義。

糖尿病是認(rèn)知功能受損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，合并糖尿病時(shí)POCD 的發(fā)生率明顯增高[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]已證實(shí)糖尿病小鼠更容易發(fā)生POCD，其原因在于手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致糖尿病本身存在的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重。最新研究[7]顯示小膠質(zhì)細(xì)胞需通過(guò)改變其糖代謝功能維持其經(jīng)典致炎途徑的激活狀態(tài)，進(jìn)而釋放大量炎癥介質(zhì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。然而，手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活伴隨的糖代謝功能改變是否參與POCD 的發(fā)生目前還不明確。

正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）是一種基于放射性核素顯像的功能成像技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能的機(jī)制研究[8]。通過(guò)對(duì)葡萄糖類似物18F-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）的追蹤顯影，PET/CT 可以客觀展現(xiàn)腦內(nèi)葡萄糖代謝的功能變化。本研究擬采用行為學(xué)及PET/CT 影像學(xué)技術(shù)，觀察手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)2 型糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響及相關(guān)腦區(qū)葡萄糖代謝水平的變化，初步探討POCD 發(fā)生的能量代謝機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 2 型糖尿病小鼠模型的建立及分組

SPF 級(jí)C57BL/6 野生型雄性小鼠40 只，4 周齡，體質(zhì)量（16±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005；小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)為SCXK（滬）2016-0020，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度約為25 ℃。操作規(guī)范均遵照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并通過(guò)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

參照文獻(xiàn)[9]的方法，選取4周齡小鼠，常規(guī)飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始60%高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飲食喂養(yǎng)第5 周，小鼠禁食16 h 后腹腔注射煙酰胺240 mg/kg，15 min 后腹腔注射鏈脲佐菌素（用pH 4.5 的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液溶解）60 mg/kg，1 次/d（煙酰胺+鏈脲佐菌素），連續(xù)注射3 d。末次注射后72 h 檢測(cè)空腹血糖（禁食12 h） ≥ 11.1 mmol/L 表示2型糖尿病模型造模成功。最終本實(shí)驗(yàn)獲得成功建模的2 型糖尿病小鼠30 只，記錄小鼠體質(zhì)量及一般情況，然后分2 批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第1 批選擇模型小鼠20 只，隨機(jī)分為對(duì)照組和腹部手術(shù)創(chuàng)傷組（手術(shù)組），10 只/組，用于術(shù)后行為學(xué)測(cè)試。術(shù)前將小鼠放入條件恐懼測(cè)試箱中進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，由測(cè)試者從飼養(yǎng)盒輕柔抓取和放回，每日適應(yīng)5 min，連續(xù)3 d；術(shù)后第3 日檢測(cè)空腹血糖水平。為確保術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能和腦影像學(xué)功能改變時(shí)間上的一致性，第2 批10 只模型小鼠同樣隨機(jī)分為對(duì)照組和手術(shù)組，5 只/組，在術(shù)后第3 日進(jìn)行腦部PET/CT 的檢測(cè)。

1.2 腹部手術(shù)創(chuàng)傷小鼠模型的建立

參照文獻(xiàn)[10-11]的方法構(gòu)建腹部手術(shù)創(chuàng)傷小鼠模型。采用4%異氟烷吸入麻醉誘導(dǎo)，2%異氟烷面罩吸入麻醉維持（氧流量1 L/min）。術(shù)中持續(xù)監(jiān)測(cè)血氧飽和度和呼吸（美國(guó)Datex-Ohmeda 監(jiān)護(hù)儀），避免低氧和呼吸抑制。小鼠仰臥固定于37 ℃恒溫加熱板上。常規(guī)消毒鋪巾，腹部正中做一長(zhǎng)約1.5 cm 的切口，充分暴露腸管后鈍性游離腸系膜上動(dòng)脈，用微血管夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈一級(jí)分支30 min 后開放，然后用無(wú)菌絲線縫合肌肉筋膜和皮膚，整個(gè)手術(shù)過(guò)程持續(xù)約45 min。術(shù)畢皮下注射生理鹽水（36 ℃，1 mL）+舒芬太尼（1 μg/kg），之后每隔12 h注射1 次，共注射3 次。對(duì)照組小鼠采用100% O2吸入45 min。術(shù)后48 h 進(jìn)行條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練，術(shù)后第3 日分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測(cè)試。

1.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

術(shù)后第3 日進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，采用自發(fā)活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)（美國(guó)Coulbourn，ACT-300A）觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)和探索行為。將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱（30 cm×30 cm×40 cm）中部開始自由探索5 min，視頻錄像后自動(dòng)分析小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程和中央格穿越次數(shù)。每只小鼠測(cè)試后使用75%乙醇清洗實(shí)驗(yàn)箱。

1.4 條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)

分為訓(xùn)練、場(chǎng)景相關(guān)性記憶測(cè)試和聲音相關(guān)性記憶測(cè)試3 個(gè)階段，同樣采用自發(fā)活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)。每只小鼠測(cè)試后使用75%乙醇清洗測(cè)試箱。

（1）訓(xùn)練階段 術(shù)后48 h 將小鼠放在測(cè)試箱中適應(yīng)180 s 之后，給予30 s 的聲音刺激（80 dB，3 600 Hz），聲音刺激的最后2 s 給予足底電擊（0.8 mA），此訓(xùn)練重復(fù)3次。然后繼續(xù)停留30 s 后放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練階段在陰暗環(huán)境下進(jìn)行。

（2）場(chǎng)景相關(guān)性記憶測(cè)試 小鼠于訓(xùn)練階段完成24 h后（即術(shù)后第3 日），將小鼠放入測(cè)試箱中觀察360 s，場(chǎng)景與訓(xùn)練時(shí)完全相同，不予聲音和電刺激，視頻錄像后自動(dòng)分析小鼠的僵直反應(yīng)時(shí)間。測(cè)試結(jié)束放回飼養(yǎng)籠。通過(guò)Freeze Frame 4 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。計(jì)算總時(shí)相中小鼠的僵直反應(yīng)時(shí)間占總觀察時(shí)間的比例用于評(píng)估小鼠的記憶 功能。

（3）聲音相關(guān)性記憶測(cè)試 場(chǎng)景相關(guān)性記憶測(cè)試后2 h，將小鼠被放入場(chǎng)景完全改變的測(cè)試箱（包括形狀、顏色、氣味及明暗）中觀察360 s，期間隨機(jī)給予與訓(xùn)練階段相同的聲音刺激3 次，每次持續(xù)60 s，視頻錄像后自動(dòng)分析小鼠的僵直反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)Freeze Frame 4 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。計(jì)算聲音刺激時(shí)相中小鼠的僵直反應(yīng)時(shí)間占總觀察時(shí)間的比例，用于評(píng)估小鼠的記憶功能。

1.5 PET/CT 檢測(cè)

對(duì)照組和手術(shù)組小鼠在術(shù)后第3 日進(jìn)行PET/CT 檢查。檢查前小鼠禁食12 h，以減少或避免因血糖因素對(duì)18F-FDG 在小鼠腦內(nèi)代謝分布的影響。尾靜脈注射300 μCi18F-FDG 30 min 后，5%異氟烷麻醉小鼠，俯臥位固定于帶保溫裝置的掃描板上，采用Siemens Inveon MicroPET/CT 成像系統(tǒng)進(jìn)行頭部顯像。掃描視野包含小鼠整個(gè)腦部及頸部，采用3D 模式采集圖像，濾波反投影法重建小鼠軸面、矢狀面、冠狀面斷層圖像進(jìn)行分析，通過(guò)PMOD軟件（PMOD Technologies，瑞士）進(jìn)行PET/CT 圖像融合并分析18F-FDG 在小鼠各腦區(qū)平均攝取率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料

與對(duì)照組相比，手術(shù)組小鼠的體質(zhì)量[ （34.067± 3.678） g vs （33.467±2.579） g，P=0.810]、 術(shù)前血糖[ （13.633±2.156） mmol/L vs （13.620±1.807） mmol/L，P=0.791]和術(shù)后第3 日血糖[ （13.514±2.812） mmol/L vs （13.746±2.418） mmol/L，P=0.814]差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，2 組小鼠的中央格穿越次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總路程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 條件性恐懼實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組比較，手術(shù)組術(shù)后第3 日?qǐng)鼍跋嚓P(guān)性記憶測(cè)試和聲音相關(guān)性記憶測(cè)試中僵直時(shí)間比例均顯著降低（均P＜0.05，圖2）。

圖1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中央穿越格次數(shù)（A）和總移動(dòng)距離（B）的比較Fig 1 Comparison of number of central grid crossings (A) and total moving distance (B) in open field experiment

圖2 條件性恐懼實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景測(cè)試和聲音測(cè)試僵直時(shí)間比例的比較Fig 2 Comparison of freezing time ratio in contextual test and tone-related test in fear conditioning experiment

2.4 18F-FDG 在各腦區(qū)的平均攝取率

基于PET/CT 融合圖像，采用相同色標(biāo)，由黑色到紅色依次顯示由低到高的18F-FDG 攝取率。結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠海馬（hippocampus，HIP）、皮質(zhì)（cortex，CTX）、紋 狀 體（corpus striatum，CPu） 和 杏 仁 核（amygdala，AMY）的18F-FDG 平均攝取率均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.05）；小腦（cerebellum，CB）、中腦（midbrain，MID）的平均攝取率的組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 小鼠各個(gè)腦區(qū)對(duì)18F-FDG 的攝取率Fig 3 Uptake rate of 18F-FDG in each brain region of mice

3 討論

條件性恐懼實(shí)驗(yàn)是評(píng)估術(shù)后認(rèn)知功能障礙的有效方法，其中場(chǎng)景相關(guān)性記憶主要檢測(cè)海馬相關(guān)性記憶功能，而聲音相關(guān)性記憶則可以檢測(cè)杏仁核、紋狀體及前額皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）等海馬非依賴性記憶功能[12]。本研究結(jié)果顯示，2 型糖尿病小鼠手術(shù)后第3 日在條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中的場(chǎng)景相關(guān)性記憶測(cè)試及聲音相關(guān)性記憶測(cè)試中的僵直反應(yīng)比例均較對(duì)照組明顯縮短，說(shuō)明手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致糖尿病小鼠術(shù)后海馬相關(guān)性和非海馬相關(guān)性記憶 受損。

本項(xiàng)目組前期研究[13]表明麻醉手術(shù)創(chuàng)傷引起的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)是POCD 發(fā)生的重要原因，而小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放炎癥介質(zhì)在此過(guò)程中扮演著重要角色。Gimeno-Bayón 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞被炎癥刺激激活后出現(xiàn)糖代謝功能的改變，表現(xiàn)為由氧化磷酸化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒獯x狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為代謝重編程（metabolic reprogramming）。糖代謝重編程的意義在于：①更加快速地為激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞提供能量。②有氧糖酵解的中間代謝物可以為激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞合成炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)提供重要的前體。并且有研究[7]證實(shí)改變小膠質(zhì)細(xì)胞的能量狀態(tài)可有效調(diào)控其激活狀態(tài)。Hovens 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷后1 周內(nèi)可觀察到海馬、紋狀體、杏仁核及前額皮質(zhì)等腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。本研究采用腦部18F-FDG PET/CT 檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3 日海馬、杏仁核、紋狀體和皮質(zhì)腦區(qū)的葡萄糖攝取率顯著增加，提示手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致2 型糖尿病小鼠術(shù)后相應(yīng)腦區(qū)的葡萄糖代謝增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致2 型糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙、小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)及腦糖代謝功能改變?cè)跁r(shí)間和空間上的相關(guān)性，提示手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活所伴隨的腦部能量狀態(tài)改變是導(dǎo)致POCD 發(fā)生的可能機(jī)制。

本研究也存在一些不足之處：①由于POCD 機(jī)制尚不明確，POCD 動(dòng)物模型的建立缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者傾向于通過(guò)動(dòng)物組間行為學(xué)差異來(lái)判斷認(rèn)知功能變化。本研究根據(jù)臨床實(shí)踐結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道選擇了腹部創(chuàng)傷手術(shù)模型，行為學(xué)結(jié)果也證實(shí)了該模型建立的有效性。② 本研究并未比較術(shù)后認(rèn)知功能和腦糖代謝功能在糖尿病小鼠和正常小鼠之間的差異，但已有文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病可加重手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的POCD 和海馬炎癥反應(yīng)[16-17]。考慮到糖尿病本身合并糖代謝紊亂，糖尿病手術(shù)患者更加容易發(fā)生POCD，我們以2 型糖尿病小鼠為研究對(duì)象探討POCD 和腦糖代謝功能改變之間的關(guān)系就更具有臨床意義。③手術(shù)創(chuàng)傷可能會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激性高血糖，本研究并未監(jiān)測(cè)術(shù)中及術(shù)后早期的血糖水平改變，但本研究監(jiān)測(cè)了術(shù)前及術(shù)后第3日的血糖水平，結(jié)果顯示組間均無(wú)明顯差異，由此可以排除術(shù)后第3 日血糖水平變化對(duì)腦糖代謝功能的影響。④本研究?jī)H觀察到2 型糖尿病小鼠POCD 和認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)的糖代謝異常在時(shí)間和空間上的相關(guān)性，但并不能充分證明兩者之間的因果關(guān)系，未來(lái)還需要通過(guò)糖代謝重編程的干預(yù)性研究予以明確。然而，本研究從腦能量代謝功能異常方面探索POCD 的機(jī)制，為該疾病的研究提供了新視角。

綜上所述，2 型糖尿病小鼠術(shù)后出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙可能與手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)葡萄糖代謝功能異常有關(guān)，其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究明確。

參·考·文·獻(xiàn)

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