LINC00511表達對鼻咽癌細胞增殖和凋亡影響及機制

黃順德 李曉華 朱浩圖

[摘要] 目的 探討長基因間非編碼RNA 00511（LINC00511）在鼻咽癌組織中的表達及其對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響和分子機制。

方法 采用實時定量PCR（RT-qPCR）分析鼻咽癌組織和癌旁組織中LINC00511和miR-590-3p表達水平。應(yīng)用雙熒光素酶報告實驗和RT-qPCR分析LINC00511對miR-590-3p調(diào)控作用。將鼻咽癌細胞SUNE-1分為si-NC組、si-LINC00511組、si-LINC00511+anti-miR-NC組、si-LINC00511+anti-miR-590-3p組。使用集落形成實驗、細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、流式細胞術(shù)檢測細胞克隆形成數(shù)、活力以及周期分布和凋亡率。

結(jié)果 鼻咽癌組織中LINC00511表達水平高于癌旁組織，miR-590-3p表達水平低于癌旁組織（t=42.522、69.402，P<0.05）。miR-590-3p是LINC00511的靶基因。與si-NC組比較，si-LINC00511組SUNE-1細胞中miR-590-3p表達顯著升高，克隆形成數(shù)、存活率、S期細胞比例顯著降低，細胞凋亡率、G 0/G 1期細胞比例顯著升高（t=22.989～56.236，P均<0.05）。與si-LINC00511+anti-miR-NC組比較，si-LINC00511+anti-miR-590-3p組SUNE-1細胞克隆形成數(shù)、存活率、S期細胞比例顯著升高，細胞凋亡率、G 0/G 1期細胞比例顯著降低（t=12.483～29.825，P均<0.05）。

結(jié)論 鼻咽癌組織中LINC00511呈高表達。干擾LINC00511表達可通過負調(diào)控miR-590-3p抑制鼻咽癌細胞增殖，誘導其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 鼻咽癌;RNA，長鏈非編碼;微RNAs;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號] R739.63;R342.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0897-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.195

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1016.001.html;2021-12-30 14：27：54

EFFECT OF LINC00511 EXPRESSION ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELLS AND ITS MECHANISM

HUANG Shunde， LI Xiaohua， ZHU Haotu

（Department of Otolaryngology， Zhengzhou Central Hospital， Zhengzhou 450000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression of long intergenic non-coding RNA 00511 （LINC00511） in nasopharyngeal carcinoma， as well as its effect on the proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells and the related molecular mechanism.

Methods Quantitative real-time PCR （RT-qPCR） was used to measure the expression levels of LINC00511 and miR-590-3p in nasopharyngeal carcinoma tissue and adjacent tissue， and dual-luciferase reporter assay and RT-qPCR were used to analyze the regulatory effect of LINC00511 on miR-590-3p. Nasopharyngeal carcinoma SUNE-1 cells were divided into si-NC group， si-LINC00511 group， si-LINC00511+anti-miR-NC group， and si-LINC00511+anti-miR-590-3p group， and colony formation assay， CCK-8 assay， and flow cytometry were used to measure the number of cell colonies， cell viability and cell cycle distribution， and apoptosis rate.

Results The expression level of LINC00511 in nasopharyngeal carcinoma tissue was significantly hig-her than that in adjacent tissue， while the expression level of miR-590-3p in nasopharyngeal carcinoma tissue was significantly lower than that in adjacent tissue （t=42.522，69.402;P<0.05）. miR-590-3p was the target gene of LINC00511. Compared with the si-NC group， the si-LINC00511 group had a significant increase in the expression of miR-590-3p in SUNE-1 cells， significant reductions in the number of cell colonies， cell viability， and the proportion of cells in S phase， and significant increases in cell apoptosis rate and the proportion of cells arrested in G 0/G 1 phase （t=22.989-56.236，P<0.05）. Compared with the si-LINC00511+anti-miR-NC group， the si-LINC00511+anti-miR-590-3p group had significant increases in the number of cell colonies， cell viability， and the proportion of cells in S phase and significant reductions in cell apoptosis rate and the proportion of cells arrested in G 0/G 1 phase （t=12.483-29.825，P<0.05）.

Conclusion LINC00511 is highly expressed in nasopharyngeal carcinoma tissue. Interfe-rence with LINC00511 can inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells and induce cell apoptosis through negative re-gulation of miR-590-3p.

[KEY WORDS]nasopharyngeal carcinoma; RNA， long noncodin; microRNAs; cell proliferation; apoptosis

鼻咽癌（NPC）是一種起源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球NPC新增病例高達12.9萬例，且90%病例發(fā)生在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，其中中國南部、東南亞和北非發(fā)病率較高[1]。由于放化療抵抗、復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移等原因，晚期NPC病人的治療效果不盡人意，5年存活率低于60%[2]。因此，研究NPC進展的分子機制對制定有效的治療策略具有重要的意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）長度超過200個核苷酸，其通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、耐藥和血管生成在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用[3-5]。長基因間非編碼RNA 00511（LINC00511）可以增強乳癌細胞干性，促進腫瘤發(fā)生[6]。敲減LINC00511可降低非小細胞肺癌細胞生存能力、加速細胞凋亡[7]。同時，miR-590-3p與LINC00511存在潛在相互作用。已有研究結(jié)果證實，NPC組織中miR-590-3p表達降低并促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲[8]。在既往研究的基礎(chǔ)上，本研究首次探討LINC00511對NPC細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，并以miR-590-3p為靶點探討其作用機制。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織來源 收集2016年2月—2018年2月間于我院行組織病理活檢的41例NPC組織及對應(yīng)的癌旁組織（正常鼻黏膜組織），其中男性31例，女性10例，年齡45～70歲，平均年齡（53.6±1.5）歲。所有NPC病人術(shù)前未接受放療或（和）化療。所有組織樣本離體后立即置于液氮中保存。本研究獲得我院倫理學委員會批準且所有病人知情同意。

1.1.2 細胞和主要試劑 NPC細胞SUNE-1購于中國科學院上海細胞研究所;逆轉(zhuǎn)錄酶以及SYBR Premix Ex Taq購于大連Takara生物公司;小干擾RNA（si-RNA）、miRNA抑制物（anti-miRNA）、熒光素酶報告基因載體均由上海吉瑪制藥公司提供;細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購于北京索萊寶公司;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司;兔源半胱氨酸蛋白酶3前體（pro-caspase3）多克隆抗體（貨號：ab44976）、兔源裂解的caspase3（Cleaved-caspase3）多克隆抗體（貨號：ab2302）購于上海艾博抗生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時定量PCR（RT-qPCR）檢測LINC00511和miR-590-3p表達 NPC組織、癌旁組織中加入TRIzol試劑提取總RNA，用雙蒸水溶解RNA樣品，紫外線分光光度法測定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA作為PCR模板，利用SYBR Premix Ex Taq進行RT-qPCR反應(yīng)。擴增參數(shù)：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。以GAPDH作為LINC00511內(nèi)參對照，以U6作為miR-590-3p內(nèi)參對照，使用2-ΔΔCt法分析LINC00511和miR-590-3p的相對表達量。所用引物及其序列見表1。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和實驗分組 SUNE-1細胞采用含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國gibco公司，貨號：12800017）、在37 ℃含體積分數(shù)0.05 CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合達到80%時進行消化傳代，每2 d換液1次。將對數(shù)期SUNE-1細胞按照每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，當細胞達50%融合時進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并將細胞分為以下4組：si-NC組（a組）、si-LINC00511組（b組）、si-LINC00511+anti-miR-NC組（c組）和si-LINC00511+anti-miR-590-3p組（d組）。參照RT-qPCR步驟檢測轉(zhuǎn)染效果，合格后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 集落形成實驗檢測克隆形成數(shù) 每組取1×103個細胞均勻鋪在6孔板，常規(guī)培養(yǎng)10 d左右，當看到集落時棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2次。用40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。棄去染色液，風干后在光鏡下觀察克隆形成數(shù)（大于50個細胞認為是有效克?。?/p>

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 以每孔3×103個細胞加入96孔板，培養(yǎng)48 h后按照試劑盒說明書加入CCK-8試劑。用酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值。細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率和周期分布①細胞凋亡測定：以預冷的PBS洗滌細胞2次，用500 μL的Annexin結(jié)合緩沖液重懸細胞并調(diào)整密度為1×109/L的細胞懸液。加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫下于暗室內(nèi)孵育15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。②細胞周期測定：每組取1×104個細胞，預冷的PBS洗滌細胞2次，隨后用體積分數(shù)0.75乙醇4 ℃下固定細胞24 h。加入PI室溫孵育20 min。流式細胞術(shù)分析G 0/G 1、S、G 2/M期細胞比例。

1.2.6 免疫印跡法（Western blot）檢測Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白表達 用RIPA緩沖液提取總蛋白，以BCA法測定濃度后，按照每孔加樣25 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和濕法轉(zhuǎn)膜。用50 g/L脫脂牛奶室溫下封閉膜2 h。分別與1∶1 000稀釋的抗Cleaved-caspase3抗體、抗pro-caspase3抗體、抗GAPDH抗體在4 ℃下孵育膜過夜。室溫下與1∶5 000稀釋的山羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。使用增強型化學發(fā)光顯色試劑盒進行顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將含有miR-590-3p結(jié)合位點的LINC00511野生型（WT）或突變型（MUT）序列插入熒光素酶報告的質(zhì)粒，合成WT-LINC00511和MUT-LINC00511。然后，將miR-590-3p mimics、miR-NC分別與上述熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染SUNE-1細胞，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定轉(zhuǎn)染48 h后熒光素酶活性變化。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00511和miR-590-3p在鼻咽癌組織表達

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，LINC00511在鼻咽癌組織（4.16±0.27）中的表達水平明顯高于癌旁組織（1.00±0.11），差異具有統(tǒng)計學意義（t=42.522，P<0.05）。miR-590-3p在鼻咽癌組織（0.17±0.04）中的表達水平明顯低于癌旁組織（1.01±0.12），差異具有統(tǒng)計學意義（t=69.402，P<0.05）。

2.2 干擾LINC00511對SUNE-1增殖和凋亡影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-LINC00511組SUNE-1細胞中LINC00511表達顯著降低，miR-590-3p表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=23.778、56.236，P<0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-LINC00511組SUNE-1細胞pro-caspase3蛋白表達顯著降低，Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=18.904、23.525，P<0.05）。與si-NC組比較，si-LINC00511組SUNE-1細胞克隆形成數(shù)、存活率、S期細胞比例均顯著降低，細胞凋亡率、G 0/G 1期細胞比例均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=22.989～51.403，P<0.05）。見圖1、2和表2。

2.3 LINC00511與miR-590-3p的靶向關(guān)系

在DIANA工具中預測LINC00511靶基因顯示，LINC00511序列中含有與miR-590-3p互補結(jié)合的位點。見圖3。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-590-3p mimics和WT-LINC00511共轉(zhuǎn)染組SUNE-1細胞相對熒光素酶活性（0.15±0.01）較miR-NC和WT-LINC00511共轉(zhuǎn)染組（0.98±0.04）顯著降低（t=34.867，P<0.05）;而miR-590-3p mimics和WT-LINC00511共轉(zhuǎn)染組SUNE-1細胞相對熒光素酶活性（0.99±0.03）與miR-NC和WT-LINC00511共轉(zhuǎn)染組（0.94±0.04）比較差異無顯著意義（t=1.732，P>0.05）。

2.4 抑制miR-590-3p并干擾LINC00511表達對SUNE-1增殖和凋亡的影響

與si-LINC00511+anti-miR-NC組相比較，si-LINC00511+anti-miR-590-3p組SUNE-1細胞克隆形成數(shù)、存活率和S期細胞比例均顯著升高，G 0/G 1期細胞比例則顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.483～26.750，P<0.05）。而與si-LINC00511+anti-miR-NC組相比較，si-LINC00511+anti-miR-590-3p組SUNE-1細胞miR-590-3p表達水平顯著降低，Cleaved-caspase3蛋白表達和凋亡率也顯著降低，pro-caspase3蛋白表達顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=17.816～39.246，P<0.05）。見圖4、5和表3。

3 討論

NPC是一種復雜的疾病，其發(fā)生與EB病毒感染、環(huán)境因素和遺傳易感性等多種因素有關(guān)[9-10]。近年來，lncRNA因其在遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因在癌癥進展中作用引起腫瘤研究者的廣泛關(guān)注，多項研究表明lncRNA可作為癌癥治療的潛在靶點[11-13]。本研究探討LINC00511在NPC進展中作用顯示，NPC組織中LINC00511表達水平較癌旁組織顯著升高。轉(zhuǎn)染si-LINC00511干擾其表達可顯著降低SUNE-1細胞的克隆形成能力和降低細胞存活率，抑制細胞周期從G 0/G 1期向S期推進，具有抗增殖作用。caspase3活化可剪切細胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，是參與細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子[14]。本文的研究結(jié)果表明，干擾LINC00511還可抑制pro-caspase3蛋白表達，促進Cleaved-caspase3蛋白表達，并誘導細胞凋亡，說明干擾LINC00511可能通過caspase3依賴途徑誘導細胞凋亡。已有研究結(jié)果顯示，干擾LINC00511表達可以降低卵巢癌細胞活力和克隆形成能力[15]。乳癌中LINC00511表達上調(diào)可以通過加速細胞G 1期向S期過渡和抑制細胞凋亡來促進腫瘤生長[16]。干擾LINC00511通過上調(diào)miR-765表達對舌鱗狀細胞癌進展具有抑制作用[17]。本文研究結(jié)果證實，LINC00511在NPC表達上調(diào)，干擾LINC00511表達可有效降低NPC細胞的增殖能力，并提高細胞凋亡率。

大量研究證實，lncRNA可以吸附miRNA抑制其表達或活性進而影響下游靶基因表達發(fā)揮作用[18-20]。LINC00511在乳癌、胰腺導管腺癌以及膠質(zhì)瘤中的致癌作用均與吸附miRNA有關(guān)[21-23]。miR-590-3p在多種人類癌癥中發(fā)揮功能作用。既往研究報道，卵巢癌、結(jié)腸癌中miR-590-3p表達升高并參與癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24-25]。然而，在乳癌中過表達miR-590-3p可抑制癌細胞存活并觸發(fā)細胞凋亡[26]。本文研究結(jié)果表明，NPC組織中miR-590-3p表達顯著降低，與ZHENG等[8]研究結(jié)果一致。此外，本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏T-qPCR證實，LINC00511對miR-590-3p具有靶向負性調(diào)控作用。由于既往研究證實過表達miR-590-3p可降低NPC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，于是推測LINC00511可能通過靶向miR-590-3p在NPC中發(fā)揮作用[8]。而將anti-miR-590-3p和si-LINC00511共轉(zhuǎn)染SUNE-1細胞進行恢復實驗的結(jié)果顯示，抑制miR-590-3p表達可顯著降低干擾LINC00511對SUNE-1細胞的克隆形成、存活、周期分布、凋亡以及pro-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表達的影響，恢復SUNE-1細胞的增殖能力和凋亡水平，這進一步說明靶向負調(diào)控miR-590-3p是LINC00511在NPC中發(fā)揮致癌作用的重要途徑。

綜上所述，干擾LINC00511通過靶向負調(diào)控miR-590-3p可抑制NPC細胞增殖并誘導細胞凋亡。因此，LINC00511是NPC的潛在治療靶點，這為進一步開發(fā)針對LINC00511的NPC治療策略奠定理論基礎(chǔ)。然而，本研究僅為體外細胞實驗，尚有待于動物實驗來驗證LINC00511的功能。

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（本文編輯 于國藝）