妊娠期高血壓疾病孕婦腸道sIgA包裹菌群構(gòu)成分析

于晉然 繆婷婷 孫卓杰 張麗霞 李靜 孫永葉

[摘要] 目的 探討腸道分泌型免疫球蛋白A（sIgA）包裹菌群構(gòu)成與妊娠期高血壓疾?。ㄈ迅甙Y）發(fā)生的關(guān)聯(lián)。

方法 選取計劃在常州市婦幼保健院分娩的20例妊高癥孕婦作為病例組，按照年齡、孕周匹配同期健康孕婦40例作為對照組。采用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總蛋白、清蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素、肌酐、尿酸、C-反應(yīng)蛋白等水平。免疫磁珠法富集分離糞便sIgA包裹菌，行16S rDNA擴增子測序。

結(jié)果 病例組孕婦孕前體質(zhì)量、初產(chǎn)婦比例、血清總膽固醇、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素、肌酐和尿酸等均顯著高于對照組（t=2.22～9.07，χ2=4.27，Z=2.12，P<0.05），而總蛋白和清蛋白水平顯著低于對照組（t=2.54、3.28，P<0.05）。兩組間sIgA包裹菌群β-多樣性比較差異有顯著性（F=9.39，P<0.01），且病例組α-多樣性香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)顯著高于對照組（Z=3.31、3.26，P<0.01）。病例組Streptococcaceae科、Enterobacteriacea科、Lactococcus屬和Streptococcus屬相對豐度明顯高于對照組（Z=2.01～3.98，P<0.05），而Enterococcaceae科和Lactobacillus屬相對豐度顯著低于對照組（Z=3.50、3.50，P<0.05）。孕婦收縮壓和舒張壓與Lactobacillus屬相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（ρ=-0.41、-0.43，P<0.05），與Lactococcus屬和Streptococcus屬相對豐度呈顯著正相關(guān)（ρ=0.31～0.50，P<0.05）。

結(jié)論 妊高癥病人腸道sIgA包裹菌群構(gòu)成發(fā)生了顯著變化，腸道sIgA包裹的Lactobacillus屬相對豐度降低，Streptococcaceae科、Streptococcus屬、Enterobacteriacea科和Lactococcus屬相對豐度升高，可能與妊高癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 高血壓，妊娠性;胃腸道微生物組;免疫球蛋白A，分泌

[中圖分類號] R714.246;R378.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0874-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.148

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1547.006.html;2021-07-07 09：06：24

COMPOSITION OF SECRETED IMMUNOGLOBULIN A-COATED INTESTINAL FLORA IN PREGNANT WOMEN WITH HYPERTENSIVE DISORDERS OF PREGNANCY

YU Jinran， MIAO Tingting， SUN Zhuojie， ZHANG Lixia， LI Jing， SUN Yongye

（School of Public Health， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the association of the composition of secreted immunoglobulin A （sIgA）-coated intestinal flora with the development of hypertensive disorders of pregnancy.

Methods A total of 20 pregnant women with hypertensive disorders of pregnancy who planned to give birth in Changzhou Maternal and Child Health Hospital were enrolled as case group， and 40 healthy pregnant women， matched for age and gestational weeks， were enrolled as control group. An automatic biochemical analyzer was used to measure the serum levels of total cholesterol， triglyceride， high-density lipoprotein cholesterol， low-density lipoprotein cholesterol， total protein， albumin， alanine transaminase， aspartate aminotransferase， glutamyl transpeptidase， urea， creatinine， uric acid， and C-reactive protein. Fecal sIgA-coated flora were enriched by magnetic activated cell sorting， and 16S rDNA amplicon sequencing was performed.

Results Compared with the control group， the case group had significantly higher pre-pregnancy body weight， proportion of primiparas， and serum levels of total cholesterol， glutamyl transpeptidase， urea， creatinine， and uric acid （t=2.22-9.07，χ2=4.27，Z=2.12，P<0.05）， as well as significantly lower serum levels of total protein and albumin （t=2.54，3.28;P<0.05）. There was a significant difference in the β-diversity of sIgA-coated flora between the two groups （F=9.39，P<0.01）， and the case group had significantly higher α-diversity Shannon index and Simpson index than the control group （Z=3.31，3.26;P<0.01）. Compared with the control group， the case group had significantly higher relative abundances of Streptococcaceae， Enterobacteriaceae， Lactococcus， and Streptococcus （Z=2.01-3.98，P<0.05） and significantly lower relative abundances of Enterococcaceae and Lactobacillus （Z=3.50，3.50;P<0.05）. Systolic pressure and diastolic pressure of pregnant women were negatively correlated with the relative abundance of Lactobacillus （ρ=-0.41，-0.43;P<0.05） and were positively correlated with the relative abundances of Lactococcus and Streptococcus （ρ=0.31-0.50，P<0.05）.

Conclusion There is a significant change in the composition of sIgA-coated intestinal flora in patientswith hypertensive disorders of pregnancy， with a reduction in the relative abundance of intestinal sIgA-coated Lactobacillus and increases in the relative abundances of Streptococcaceae， Streptococcus， Enterobacteriaceae， and Lactococcus， which may be associated with the development and progression of hypertensive disorders of pregnancy.

[KEY WORDS]hypertension， pregnancy-induced; gastrointestinal microbiome; immunoglobulin A， secretory

妊娠期高血壓疾?。ㄈ迅甙Y）是妊娠與高血壓并存的一組疾病，能夠使高達(dá)10%的妊娠復(fù)雜化[1]，出現(xiàn)胎盤早剝、早產(chǎn)、胎兒生長受限甚至死亡等不良結(jié)局。該組疾病可分為妊娠期高血壓、子癇前期和慢性高血壓并發(fā)子癇前期等亞型。據(jù)調(diào)查，全球妊娠期高血壓和子癇前期的患病率分別為1.8%～4.4%和0.2%～9.2%[2]。隊列研究發(fā)現(xiàn)，曾患妊高癥的女性在未來患高血壓等心血管疾病的風(fēng)險增高[3-4]。因此，妊高癥的防治是一項重要的公共衛(wèi)生問題。目前，關(guān)于妊高癥的發(fā)病機制主要包括遺傳、自身免疫、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和炎癥反應(yīng)等[5-8]。人體龐大而復(fù)雜的腸道菌群在免疫、代謝和營養(yǎng)吸收等過程中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，孕婦腸道菌群與血壓關(guān)系密切[9-10]，臭桿菌屬（Odoribacter）產(chǎn)生的丁酸鹽可能通過抑制纖溶酶原激活物抑制劑-1的產(chǎn)生來控制宿主血壓[9]。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是由腸黏膜組織分泌的抗體，sIgA與其包裹的25%～75%腸道菌群共同富集于結(jié)腸黏膜外層，該抗體與結(jié)腸黏膜上皮表面的結(jié)合能力對于其排除致病菌和與共生菌體保持互惠關(guān)系至關(guān)重要[11]。目前，有關(guān)sIgA包裹菌群與妊高癥的研究甚少。本研究旨在比較常州地區(qū)妊高癥孕婦與健康孕婦腸道sIgA包裹菌群構(gòu)成的差異，為預(yù)防和干預(yù)妊高癥提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年10—12月計劃在常州市婦幼保健院分娩的妊高癥孕婦20例作為病例組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：孕前血壓正常，妊娠20周后出現(xiàn)血壓升高（收縮壓≥18.67 kPa和（或）舒張壓≥12.00 kPa），伴或不伴有蛋白尿（24 h尿蛋白≥0.3 g）[2]。同期選擇與病例組孕婦年齡、孕周相匹配的正常孕婦40例作為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕期有吸煙、飲酒等不良嗜好;近1個月內(nèi)使用過抗生素;患有心臟疾病、炎癥性腸病、慢性高血壓、其他妊娠并發(fā)癥等疾病的孕婦。收集研究對象的基本信息，持續(xù)追蹤孕婦到產(chǎn)前，期間如果出現(xiàn)符合排除標(biāo)準(zhǔn)的疾病則將該孕婦從本研究中剔除。本項研究取得常州市婦幼保健院倫理委員會的批準(zhǔn)，并且所有納入的研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與檢測

采集孕婦空腹靜脈血5 mL，分離血清分裝后凍存于-80 ℃冰箱中備用。采用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總蛋白、清蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、尿素、肌酐、尿酸、C-反應(yīng)蛋白（CRP）等水平。采集孕婦至少0.5 g新鮮糞便，置于-80 ℃冰箱中備用。所有研究對象的糞便標(biāo)本收集完成后，采用免疫磁珠法富集分離sIgA包裹菌群[12]，使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，然后送至武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司，以基于Illumina MiSeq 2500平臺進(jìn)行16S rDNA V4區(qū)高通量測序。然后，使用FLASH 1.2軟件去除低質(zhì)量的序列，拼接雙末端reads以獲得tags，最后通過UPARSE 7.0軟件將tags按照97%的相似性聚類生成OTUs（Operational Taxonomic Units）。與Greengene數(shù)據(jù)庫（201305版本）比對后應(yīng)用RDP Classifier 2.2軟件進(jìn)行物種分類，最小置信度閾值為0.6。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布計量資料以±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用Student’s t檢驗;非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料以數(shù)量（百分比）表示，數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗。通過在線分析工具M(jìn)icrobiomeAnalyst進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基于Bray-Curtis距離、采用置換多因素方差分析（Permutational MANOVA）估算菌群β-多樣性，可視化應(yīng)用主坐標(biāo)分析（PCoA）;采用Mann-Whitney U檢驗估算菌群α-多樣性（香濃指數(shù)、辛普森指數(shù)和chao1指數(shù)）和相對豐度，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制箱線圖和百分條圖。差異菌屬與舒張壓和收縮壓的關(guān)系用Spearman相關(guān)性分析，用HemI 1.0軟件繪制相關(guān)性熱圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦一般資料比較

病例組和對照組孕婦年齡、孕周、孕前BMI、孕期體質(zhì)量增長和孕次相比較差異均無顯著性（P>0.05）。與對照組相比較，病例組的孕前體質(zhì)量、收縮壓和舒張壓以及初產(chǎn)婦比例均明顯增高（t=2.56～9.07，χ2=4.27，P<0.05）。見表1。

2.2 兩組孕婦血生化指標(biāo)比較

兩組孕婦血清TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST和CRP水平相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。病例組血清TC、GGT、尿素、肌酐和尿酸水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.22～4.20，Z=2.12，P<0.05）;而總蛋白以及清蛋白水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.54、3.28，P<0.05）。見表2。

2.3 兩組孕婦腸道sIgA包裹菌群比較

從兩組60例孕婦的糞便標(biāo)本中分離出sIgA包裹菌群，高通量測序得到3 433 601個高質(zhì)量序列，被聚類生成1 794個OTUs。PCoA結(jié)果表明，兩組β-多樣性有顯著分離（F=9.39，P<0.01）（圖1）。進(jìn)一步用α-多樣性評估菌群豐富性和均勻性，結(jié)果顯示病例組香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)明顯高于對照組（Z=3.31、3.26，P<0.01），

而chao1指數(shù)兩組間比較差異無顯著性（P>0.05）（圖2）。在門水平上，病例組和對照組孕婦腸道sIgA 包裹菌群最豐富的為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）;在科水平上，病例組腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、V1和鏈球菌科（Streptococcaceae）相對豐度與對照組相比顯著增加（Z=2.01～3.98，P<0.05），而腸球菌科（Entero-coccaceae）相對豐度與對照組相比顯著降低（Z=3.50，P<0.05）;在屬水平上，兩組間乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中病例組Lactobacillus相對豐度顯著低于對照組（Z=3.50，P<0.05），Lactococcus和Streptococcus相對豐度顯著高于對照組（Z=2.02、3.98，P<0.05）。見圖3。

2.4 孕婦腸道sIgA包裹菌屬與血壓相關(guān)性分析

Lactobacillus相對豐度與收縮壓和舒張壓呈顯著負(fù)相關(guān)（ρ=-0.41、-0.43，P<0.05），Lactococcus相對豐度與收縮壓和舒張壓呈正相關(guān)（ρ=0.31、0.34，P<0.05），Streptococcus相對豐度與收縮壓和舒張壓也呈正相關(guān)（ρ=0.48、0.50，P<0.05）。

3 討論

妊高癥是較為嚴(yán)重的妊娠期并發(fā)癥，也是全球孕產(chǎn)婦死亡的第二大原因[13]。該疾病病因復(fù)雜，包括但不限于血管內(nèi)皮損傷、免疫平衡失調(diào)和炎癥反應(yīng)等[5-8]。因此，探尋妊高癥的特征指標(biāo)對促進(jìn)孕產(chǎn)婦和圍生兒的健康有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，妊高癥病人血清TC水平顯著高于對照組，但數(shù)值仍在妊娠晚期孕婦正常血脂參考范圍內(nèi)[14]。妊高癥孕婦全身小動脈痙攣會導(dǎo)致肝、腎等臟器內(nèi)皮細(xì)胞受損、缺血及低氧、腫脹等，增加了膜通透性，進(jìn)而出現(xiàn)血清總蛋白和清蛋白丟失[15]、肝細(xì)胞微粒體內(nèi)的GGT釋放入血[16]以及腎小球濾過率下降，使得血清中尿素、肌酐和尿酸含量增多[17]。本文研究結(jié)果與其一致。

本研究顯示，妊高癥孕婦和對照組孕婦的腸道sIgA包裹菌群β-多樣性有明顯分離，說明兩組孕婦腸道sIgA包裹菌群整體構(gòu)成顯著不同。α-多樣性分析結(jié)果顯示，與對照組相比，病例組香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)明顯增高，說明妊高癥孕婦sIgA包裹菌群豐富性和均勻性高。本研究菌群相對豐度結(jié)果顯示，病例組Streptococcaceae科和Streptococcus屬相對豐度均明顯高于對照組，并且Streptococcus屬相對豐度與孕婦血壓呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵大豆蛋白有降壓作用，推測與大豆蛋白中未被吸收的肽導(dǎo)致Streptococcaceae水平降低有關(guān)[18]。一項對原發(fā)性高血壓病人Streptococcus的研究結(jié)果與本文的研究相同[19]。有證據(jù)表明，Streptococcus具有降低膽堿水平的作用[20]，而膽堿可以乳化膽固醇，預(yù)防高血壓的發(fā)生。上述研究結(jié)果提示Streptococcaceae科和Streptococcus屬可能通過降低機體膽堿水平而參與妊高癥的發(fā)生發(fā)展。本研究中病例組腸道致病菌Enterobacteriaceae科相對豐度明顯高于對照組。以往多項基于成年高血壓病人進(jìn)行的研究報道均與本文的研究結(jié)果相一致[21]。此外，MUKHOPADHYA等[22]認(rèn)為，Enterobacteriaceae家族是誘發(fā)腸道內(nèi)低度炎癥的強勢候選物種，提示Enterobacteriaceae科可能通過炎癥反應(yīng)而參與妊高癥的發(fā)生發(fā)展。本研究中，病例組Lactobacillus屬相對豐度顯著低于對照組，可能與Lactobacillus能夠產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、改善血脂和減低體質(zhì)量等有關(guān);而病例組Lactococcus屬相對豐度較對照組高，并且Lactococcus屬相對豐度與孕婦血壓也呈正相關(guān)。有研究顯示，Lactococcus屬豐度與未經(jīng)治療的高血壓居民的血壓水平呈正相關(guān)[23]。因此，Lactococcus屬相對豐度升高可能與妊高癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，妊高癥病人腸道sIgA包裹菌群構(gòu)成較健康孕婦發(fā)生了顯著變化。孕婦腸道中sIgA包裹的Lactobacillus屬相對豐度降低，而Streptococcaceae科、Streptococcus屬、Enterobacteriaceae科和Lactococcus屬相對豐度升高，可能與妊高癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。未來可能通過靶向調(diào)節(jié)腸道菌群來達(dá)到預(yù)防和控制妊高癥的目的。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）