痛風(fēng)湯作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討

溫新麗 賀玉偉 薛曉梅 吳欣 賈兆通

[摘要] 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，探究痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的可能作用機(jī)制。

方法 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中國(guó)中藥整合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）、Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫(kù)（SEA），檢索并收集痛風(fēng)湯的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。通過(guò)人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards）查找痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)基因，使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建痛風(fēng)湯的“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)湯各成分作用靶點(diǎn)間的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)和痛風(fēng)靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用DAVID生物信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)痛風(fēng)湯的作用靶點(diǎn)及痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)痛風(fēng)湯活性成分的真實(shí)靶點(diǎn)，通過(guò)SwissDock進(jìn)行分子對(duì)接。

結(jié)果 共從痛風(fēng)湯中篩選得到82個(gè)候選活性成分，并篩選出其成分相關(guān)靶點(diǎn)基因244個(gè)，痛風(fēng)致病基因978個(gè)。通過(guò)KEGG分析找到痛風(fēng)湯與痛風(fēng)作用的共同通路，包括Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway，其中Pathway in cancer是最關(guān)鍵通路。通路中的最關(guān)鍵靶點(diǎn)為TP53，作用于TP53的化合物為土茯苓和紅花中的槲皮素（Quercetin）、紅花中的木犀草素（Luteolin）、蒼術(shù)中的漢黃芩素（Wogonin）。通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了槲皮素中有59個(gè)真實(shí)靶點(diǎn)與TP53相互作用，木犀草素中25個(gè)真實(shí)靶點(diǎn)與TP53相互作用，漢黃芩素中有2個(gè)真實(shí)靶點(diǎn)與TP53相互作用。在木犀草素、槲皮素真實(shí)靶點(diǎn)中分別選取FLT3、MAOA與相應(yīng)化合物進(jìn)行分子對(duì)接;選取NOS2、PTGS2與漢黃芩素做分子對(duì)接。

結(jié)論 痛風(fēng)湯活性成分可調(diào)控痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)信號(hào)通路。

[關(guān)鍵詞] 痛風(fēng)湯;痛風(fēng);中藥藥理學(xué);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

[中圖分類號(hào)] R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）06-0846-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.203

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1017.007.html;2021-12-30 14：23：39

AN INVESTIGATION OF MECHANISM OF ACTION OF GOUT DECOCTION USING NETWORK PHARMACOLOGY AND MOLECULAR DOCKING APPROACHES

WEN Xinli， HE Yuwei， XUE Xiaomei， WU Xin， JIA Zhaotong

（Department of Endocrinology and Metabology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To explore the possible mechanism of action of gout decoction in the treatment of gout using network pharmacology and molecular docking approaches.

Methods The active components of gout decoction and its corresponding targets were searched for in the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）， Traditional Chinese Medicine Integrated Database （TCMID）， and the Similarity Ensemble Approach （SEA）. The human genome annotation database Genecards was used to search for genes associated with the development of gout; Cytoscape 3.7.1 was used to build the “herb-component-target” network of gout decoction， protein-protein interaction （PPI） network of various component targets of gout decoction， and the PPI network between the targets of gout. The bioinformatic resource database， Database for Annotation， Visualization， and Integrated Discovery， was used to perform Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis for targets of gout decoction and targets associated with the development of gout; SwissTargetPrediction was used to predict the actual targets of active components in gout decoction; SwissDock was used to perform molecular docking.

Results Totally 82 candidates for active components were screened out from the gout decoction， and 244 component-related target genes and 978 pathogenic genes for gout were obtained. The KEGG pathway analysis revealed the co-pathways for gout decoction and gout， including pathway in cancer， NOD-like receptor signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway， and T cell receptor signaling pathway， among which pathway in cancer was the most critical one. The most critical target in the pathways was TP53， which was targeted by compounds including quercetin in Smilax glabra and Carthamus tinctorius， luteolin in Carthamus tinctorius， and wogonin in Rhizoma Atractylodis. The target prediction found that the number of actual targets interacting with TP53 was 59 for quercetin， 25 for luteolin， and 2 for wogonin. FLT3 and MAOA were selected from the actual targets of quercetin and luteolin， respectively， for molecular docking with corresponding compounds; NOS2 and PTGS2 were selected for molecular docking with wogonin.

Conclusion Active components in gout decoction can regulate the pathways associated with the development of gout.

[KEY WORDS]Tongfeng decoction; gout; pharmacology; network pharmacology; molecular docking simulation

近年來(lái)痛風(fēng)已經(jīng)成為繼糖尿病之后的第二大代謝系統(tǒng)疾病[1]。相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，痛風(fēng)病人已超過(guò)8 000萬(wàn)人，而且病人人數(shù)以9.7%的年增長(zhǎng)率增加[2]。痛風(fēng)的病理特征是尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和組織中，進(jìn)而觸發(fā)免疫細(xì)胞引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。其主要危險(xiǎn)因素是高尿酸血癥，即血清尿酸鹽水平升高。對(duì)于大多數(shù)痛風(fēng)病人來(lái)說(shuō)，排泄不足是高尿酸血癥的主要原因[4]。痛風(fēng)如得不到及時(shí)有效的治療可能累及腎臟，導(dǎo)致痛風(fēng)性腎病，嚴(yán)重者出現(xiàn)腎功能不全等[5]。目前西醫(yī)治療可產(chǎn)生諸多副作用，如胃腸道反應(yīng)、皮疹、肝腎功能損傷等。此外，此類藥物不能預(yù)防、阻止或逆轉(zhuǎn)痛風(fēng)的進(jìn)程。中藥復(fù)方和從中草藥分離出的某些化合物已被用于治療痛風(fēng)，效果令人滿意 [6]，并且不良反應(yīng)低于西藥[7]。痛風(fēng)湯是以土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花組合形成基礎(chǔ)方，病人合并不同痛風(fēng)癥狀時(shí)加減不同藥材以控制癥狀[8]。痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)效果良好，無(wú)顯著毒副作用，復(fù)發(fā)率低[9]。目前尚無(wú)系統(tǒng)研究痛風(fēng)湯物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療痛風(fēng)機(jī)制的報(bào)道。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示痛風(fēng)湯活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，以探討其治療痛風(fēng)的機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 痛風(fēng)湯活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的獲取

分別以“威靈仙”、“蒼術(shù)”、“薏苡仁”、“澤瀉”、“桃仁”、“紅花”、“土茯苓”、“粉萆薢”、“蠶沙”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php）[10]中，檢索獲得其化學(xué)成分;在檢索結(jié)果中限定口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選。同時(shí)在中國(guó)中藥整合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid）[11]平臺(tái)中以“地龍”為關(guān)鍵詞，檢索獲得其化學(xué)成分“蚯蚓素”。“蚯蚓素”的相應(yīng)靶點(diǎn)通過(guò)Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫(kù)（SEA，http：//sea.bkslab.org）[12]進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建痛風(fēng)湯的“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)基因的獲取

在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards，https：//www.genecards.org）中以“gout”為關(guān)鍵詞檢索與痛風(fēng)相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

所有的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)均來(lái)自STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）的分析結(jié)果。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建痛風(fēng)湯靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)、痛風(fēng)湯和痛風(fēng)共同涉及的關(guān)鍵通路的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測(cè)痛風(fēng)湯某些成分的真實(shí)靶點(diǎn)。

1.4 KEGG信號(hào)通路富集分析

將痛風(fēng)湯靶點(diǎn)和痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的基因名導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）[13]進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，保存結(jié)果。選取滿足FDR<0.05的通路，并根據(jù) FDR值的大小繪制氣泡圖。

1.5 分子對(duì)接

應(yīng)用SwissDock（http：//www.swissdock.ch）將FLT3（PDB ID： 4rt7）、MAOA（PDB ID： 2Z5X）分別與槲皮素、木犀草素進(jìn)行分子對(duì)接;選取NOS2（PDB ID： 4NOS）、PTGS2（PDB ID： 5ikq）與漢黃芩素進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果通過(guò)PyMOL 1.7.0（美國(guó)Schrdinger， LLC）展示。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

共從痛風(fēng)湯10味藥材中篩選出痛風(fēng)湯活性成分82個(gè)，活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)244個(gè)。通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的痛風(fēng)湯“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1。

2.2 痛風(fēng)湯作用靶點(diǎn)和痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將痛風(fēng)湯作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取其PPI網(wǎng)絡(luò)的原始數(shù)據(jù)并保存，使用Cytoscape 3.7.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。剔除未與網(wǎng)絡(luò)連接的3個(gè)作用靶點(diǎn)，此網(wǎng)絡(luò)共包含了241個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖2A）。靶點(diǎn)與靶點(diǎn)的連接度越高，重要性越強(qiáng)，顏色越趨向于紅色，且靶點(diǎn)的面積較大。因此，痛風(fēng)湯靶點(diǎn)中連接度最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別為AKT1、ALB、IL-6、TP53和MAPK-3。對(duì)978個(gè)痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得了痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2B）。該網(wǎng)絡(luò)減去未結(jié)合的180個(gè)作用靶點(diǎn)，共包含798個(gè)痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)基因。痛風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)中連接度最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別為IL-6、INS、GAPDH、TNF和ALB。

2.3 痛風(fēng)湯和痛風(fēng)涉及的細(xì)胞信號(hào)通路

通過(guò)KEGG通路富集分析找到痛風(fēng)湯涉及的26個(gè)重要信號(hào)通路（圖3A）和痛風(fēng)發(fā)病涉及的14個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路（圖3B）。痛風(fēng)湯靶點(diǎn)通路與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路相互重疊的共同通路為4個(gè)，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。由于KEGG分析中Pathway in cancer的-Log 10FDR值最大，因此Pathway in cancer對(duì)于痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的機(jī)制是最重要的。

2.4 痛風(fēng)湯與痛風(fēng)涉及共同細(xì)胞信號(hào)通路的PPI網(wǎng)絡(luò)

從Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway共4個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路中找到痛風(fēng)湯和痛風(fēng)均涉及的靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，找到各PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖4）。Cytoscape分析中，靶點(diǎn)顏色越趨向紅色，且靶點(diǎn)面積越大，即被認(rèn)為關(guān)鍵程度越高。因此，Pathway in cancer通路中涉及的排名前5位的最關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為TP53、PTGS2、IL6、MAPK1和RELA。

2.5 TP53及其對(duì)應(yīng)藥物活性成分真實(shí)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

痛風(fēng)湯中對(duì)應(yīng)TP53靶點(diǎn)的活性成分是土茯苓和紅花中的槲皮素（Quercetin）、紅花中的木犀草素（Luteolin）和蒼術(shù)中的漢黃芩素（Wogonin）。通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到槲皮素的59個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)、木犀草素的25個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和漢黃芩素的2個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。分別利用這些化合物的真實(shí)靶點(diǎn)構(gòu)建了與TP53的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5），顯示出槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等痛風(fēng)湯活性成分調(diào)控TP53基因的機(jī)制。

2.6 分子對(duì)接

選取FLT3、MAOA分別與木犀草素、槲皮素進(jìn)行分子對(duì)接，選取NOS2、PTGS2與漢黃芩素進(jìn)行了分子對(duì)接，揭示了痛風(fēng)湯的特定活性成分與其靶點(diǎn)的結(jié)合模式（圖6）。

3 討論

痛風(fēng)的臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥及其引發(fā)的急性炎癥[14]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高尿酸血癥是因濕濁、熱毒、血瘀、痰凝所致，需以祛濕通絡(luò)、泄?jié)峤舛緸橹委熢瓌t[15]。國(guó)醫(yī)大師朱良春認(rèn)為濕濁瘀滯內(nèi)阻，才是痛風(fēng)發(fā)病的主要原因，并將其命名為“濁瘀痹”[16]。痛風(fēng)湯是治療“濁瘀痹”的專病專方。因此有必要深入研究其組方規(guī)律和作用機(jī)制。

痛風(fēng)湯的基礎(chǔ)方（土茯苓、萆薢、蒼術(shù)、生薏苡仁、威靈仙、蠶沙、地龍、澤瀉、桃仁、紅花）可促進(jìn)濁毒泄化、瘀結(jié)解除。在此基礎(chǔ)上可加入其他藥材，做到辨證論治，個(gè)體化給藥[8]。由于中藥復(fù)方具有藥效的整體性和成分的復(fù)雜性，揭示復(fù)方中有效成分與靶點(diǎn)、信號(hào)途徑之間的關(guān)系，是研究中藥復(fù)方的關(guān)鍵[17]。同樣，深入理解痛風(fēng)湯治療痛風(fēng)的作用需要一種揭示成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)方法。中藥復(fù)方的藥理作用可能是由于多種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控多個(gè)細(xì)胞信號(hào)途徑的過(guò)程。系統(tǒng)生物學(xué)中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也許能解決中藥作用機(jī)制復(fù)雜性的問(wèn)題。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的目的不是確定單個(gè)候選化合物，而是全面分析復(fù)雜體系，構(gòu)建復(fù)雜成分與其藥理學(xué)作用之間的網(wǎng)絡(luò)[18]，其整體和系統(tǒng)特征與中藥發(fā)揮作用的原理一致。

本研究中KEGG分析結(jié)果顯示，痛風(fēng)湯的藥理作用涉及27個(gè)信號(hào)通路，而與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵通路共有14個(gè)。痛風(fēng)湯藥理作用與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)通路均涉及的共同通路為4個(gè)，分別為Pathway in cancer、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和T cell receptor signaling pathway。這樣的思路與大部分中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不同。細(xì)胞信號(hào)通路包含了多種靶點(diǎn)，而且每個(gè)靶點(diǎn)被不同的化合物所影響。但是，每個(gè)信號(hào)通路所代表的生物學(xué)效應(yīng)是固定的，這樣的生物學(xué)效應(yīng)不會(huì)因?yàn)椴煌衔锇邢蛴谕分胁煌陌悬c(diǎn)而發(fā)生改變。因此，不同化合物作用于不同的蛋白靶點(diǎn)時(shí)，很可能具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。只要這些蛋白靶點(diǎn)涉及同一信號(hào)通路即可。因此，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過(guò)程中，可以預(yù)先忽略中藥復(fù)方的靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)中共同靶點(diǎn)，分別尋找相關(guān)靶信號(hào)通路，進(jìn)而得到共同信號(hào)通路。這可能是中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的改進(jìn)。

本文研究結(jié)果還顯示，痛風(fēng)湯涉及的最重要通路是Pathways in cancer，其中TP53為關(guān)鍵靶點(diǎn)?？捎绊慣P53的化合物分別是土茯苓和紅花中的槲皮素、紅花中的木犀草素、蒼術(shù)中的漢黃芩素。槲皮素是日常飲食中含量最豐富的類黃酮之一，它可抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）催化的尿酸和超氧自由基的生成，可以作為預(yù)防痛風(fēng)和過(guò)氧化損傷的潛在化合物[19]。木犀草素是芹菜和青椒的主要成分之一，可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制XOD[20]。在高尿酸血癥小鼠中，槲皮素與木犀草素的這種作用有助于增強(qiáng)尿酸排泄并改善高尿酸血癥引起的腎功能不全。此外，還有研究顯示，木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷還可減輕單鈉尿酸鹽晶體引起的小鼠足腫脹和炎癥，其機(jī)制可能與它們降低IL-1β和TNF-α的水平有關(guān)[21]。漢黃芩素對(duì)XOD也有較強(qiáng)的抑制作用[22]，其IC 50=157.38 μmol/L[23]。因此有研究指出，漢黃芩素可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在化合物[24]。

該研究也存在一些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在的共性問(wèn)題。例如本研究中使用的痛風(fēng)湯活性成分來(lái)自TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)化合物的OB和DL的大小來(lái)決定是否候選為活性成分。但是本研究中動(dòng)物藥材地龍的唯一候選成分蚯蚓素，來(lái)自TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)，沒(méi)有按照OB和DL的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選。因此，在今后的研究中需要統(tǒng)一篩選標(biāo)準(zhǔn)，且需要更多來(lái)自地龍的候選成分。另外在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，許多文獻(xiàn)報(bào)道的活性化合物未達(dá)到數(shù)據(jù)庫(kù)的OB和DL大小標(biāo)準(zhǔn)而被從活性成分的列表中剔除。在今后的研究中需要對(duì)這部分化合物進(jìn)行重新評(píng)價(jià)，納入活性成分列表進(jìn)行深入發(fā)掘。未來(lái)在解決以上共性問(wèn)題的基礎(chǔ)上，需要在細(xì)胞水平驗(yàn)證活性成分-靶點(diǎn)、成分-通路的關(guān)系，這樣才能驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，這對(duì)于闡明痛風(fēng)湯作用機(jī)制、篩選其中的活性成分具有重要意義。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）