微環(huán)境酸堿度在組織工程骨再生中作用的研究進(jìn)展

李佩儀 張新春

中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室 廣州510055

頜骨是整個顏面部外形的支撐結(jié)構(gòu)，也是咀 嚼器官、語言器官、呼吸器官的重要組成部分，繼發(fā)于外傷、腫瘤、炎癥等常見疾病的口腔頜面部骨缺損從生理、心理兩方面給患者造成嚴(yán)重影響。目前頜面骨再生仍以傳統(tǒng)的自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨移植為主，這些方法具有供體受限、受體排斥、疾病傳播等弊端，社會醫(yī)療成本較高，尋找合適的頜面骨替代品一直是口腔骨修復(fù)研究的重要方向[1?2]。

組織工程骨因其來源廣泛、制作方便、無免疫原性等優(yōu)點，已逐漸成為臨床骨缺損修復(fù)的研究熱點[3]。組織工程骨植入體內(nèi)后，細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、生長因子及機(jī)體對材料的反應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)成了成骨微環(huán)境，是調(diào)動機(jī)體自身修復(fù)能力和生物材料再生功能的關(guān)鍵。成骨微環(huán)境的酸堿度參與免疫調(diào)控、血管再生和新骨形成，尤與骨骼系統(tǒng)直接相關(guān)，影響骨再生細(xì)胞功能及礦物鹽沉積，其水平與機(jī)體損傷和植入材料的降解產(chǎn)物有關(guān)，本文綜述成骨微環(huán)境酸堿度在組織工程骨再生中的研究進(jìn)展，為頜面人工骨材料研發(fā)與轉(zhuǎn)化提供參考。

1 微環(huán)境酸堿度與組織工程骨再生

酸是細(xì)胞能量代謝的副產(chǎn)物，葡萄糖分子既可通過無氧代謝生成乳酸，也可通過有氧代謝轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 和二氧化碳，二氧化碳在體液中形成的碳酸和碳酸氫鹽是機(jī)體pH 緩沖系統(tǒng)的重要組成部分[4]。健康的機(jī)體可通過呼吸、腎臟排泄和骨骼緩沖等過程，調(diào)節(jié)二氧化碳、碳酸氫鹽和H+間平衡以穩(wěn)定pH[5]。腎病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病等疾病將導(dǎo)致系統(tǒng)性酸中毒或堿中毒，而腫瘤、創(chuàng)傷、感染和炎癥等病理狀態(tài)將干擾局部pH 緩沖系統(tǒng)，造成微環(huán)境酸堿失衡。骨組織羥磷灰石可根據(jù)體液酸堿度溶出或沉積以緩沖pH 變化[6?7]。此外，骨相關(guān)細(xì)胞對pH變化敏感，胞外H+在激活破骨細(xì)胞骨吸收的同時，抑制成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)、減少礦物鹽沉積[8?11]；堿性環(huán)境則刺激成骨細(xì)胞功能、抑制破骨活性，促進(jìn)骨形成[12?13]。

頜面骨缺損由于血供減少、無氧代謝增加，血腫、感染、炎癥等反應(yīng)聚積乳酸，形成局部酸性微環(huán)境。Hazehara?Kunitomo等[14]測量小鼠拔牙窩內(nèi)pH，在最初2 d，pH 由7.4 降至6.8，7 d 后恢復(fù)至7.0左右。而組織工程骨因血管長入受限、炎癥反應(yīng)及人工骨內(nèi)細(xì)胞所處空間有限等因素，周圍體液緩沖效果較弱，易積聚酸性代謝產(chǎn)物，使細(xì)胞對pH 變化的敏感性上升[13,15]。微環(huán)境pH 是組織工程骨再生中重要的物理因素，影響人工骨表面蛋白吸附、成骨相關(guān)細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化、骨基質(zhì)分泌成熟、生物礦化，以及骨缺損區(qū)炎癥反應(yīng)和血管重建等骨再生過程，了解微環(huán)境pH 在組織工程骨再生中的作用可為頜面骨材料研發(fā)和臨床骨修復(fù)治療提供參考[9?11,16]。

1.1 組織工程骨表面蛋白吸附

來源于血液、細(xì)胞外液的蛋白吸附至植入材料表面是組織工程骨再生的第一階段，直接影響材料的細(xì)胞相容性[17]。骨植入材料表面蛋白可與胞膜整合素結(jié)合，為細(xì)胞黏附提供識別位點；同時控制晶體成核和生長，是生物礦化的關(guān)鍵[18?19]。

蛋白質(zhì)在材料表面的吸附涉及范德華力，疏水作用力、靜電力及氫鍵作用，影響因素包括蛋白種類、構(gòu)象、材料表面化學(xué)、粗糙度、溶液pH值等，而溶液pH 值是改變蛋白電負(fù)性和構(gòu)象的關(guān)鍵因素[17?18]。蛋白質(zhì)是具有酸性和堿性官能團(tuán)的生物兩親性分子，總電荷與外界pH 值和蛋白等電點（isoelectric point，pI）有關(guān)。Yadav 等[20]調(diào)節(jié)溶液pH 使溶菌酶帶正電荷，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）帶負(fù)電荷，帶正電的溶菌酶可強(qiáng)力吸附于二氧化硅納米粒子的負(fù)電表面，吸附量隨溶菌酶濃度上升而上升，吸附最大值隨溶液pH接近溶菌酶等電點（pI為11.1[21]）而增加。相反，帶負(fù)電的BSA 無吸附現(xiàn)象。除蛋白?材料間的靜電作用力以外，pH 還通過改變蛋白構(gòu)象影響二者間相互作用，這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能與蛋白內(nèi)部電荷分布不均有關(guān)[22]。Kumar等[23]觀察二氧化硅納米粒子和溶菌酶的吸附行為，隨溶液pH 下降（pH 9.0/7.0/5.0），溶菌酶構(gòu)象改變，納米顆粒表面蛋白吸附系數(shù)升高但蛋白吸附總量下降。Raoufi等[24]進(jìn)一步利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法，監(jiān)測纖連蛋白在金納米顆粒上的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)酸性pH 解折疊纖連蛋白，降低其親和力，減少吸附。

微環(huán)境酸堿度通過靜電作用力和蛋白構(gòu)象初步篩選材料表面蛋白，細(xì)胞對不同蛋白、不同構(gòu)象的黏附位點不盡相同，由此影響細(xì)胞黏附并改變整合素相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響骨再生[25]。

1.2 組織工程骨表面細(xì)胞遷移、黏附與增殖

骨修復(fù)相關(guān)細(xì)胞在人工骨材料表面的遷移、黏附與增殖是骨質(zhì)形成和生物礦化的前期基礎(chǔ)，決定新骨形成和骨整合效果[26?27]。

胞外酸性微環(huán)境不利于間充質(zhì)干細(xì)胞（mes?enchymal stem cells，MSCs）的遷移與黏附，但對破骨細(xì)胞的遷移黏附有促進(jìn)作用。酸性預(yù)處理（pH6.8）的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone mar?row mesenchymal stem cells，hBMMSCs）遷 移 與黏附能力顯著下降[14]。但Ahn等[28]研究認(rèn)為，胞外酸中毒可刺激破骨細(xì)胞合成含有精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸序列的骨橋蛋白，激活Pyk2、Cbl?b、Src等相關(guān)信號通路，促進(jìn)其遷移黏附。進(jìn)一步研究在酸性環(huán)境下阻斷了巨噬細(xì)胞酸敏感離子通道1a（activated acid?sensing ion channel 1a，ASIC1a），發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞及其分化的破骨細(xì)胞遷移黏附能力下降，顯示酸性環(huán)境可能通過ASIC1a/整合素ανβ?3/Pyk2/Src 促進(jìn)破骨細(xì)胞的遷移黏附[29]。破骨細(xì)胞遷移黏附能力的上升還可能與酸性微環(huán)境改變胞膜整合素蛋白構(gòu)象有關(guān)[30]。整合素是胞膜上的異二聚體α/β跨膜蛋白，參與包括遷移和黏附在內(nèi)的多種細(xì)胞活動。分子動力學(xué)模擬研究顯示，酸性pH使整合素構(gòu)象由平衡態(tài)轉(zhuǎn)向高親和力的延伸?開放狀態(tài)，通過開放ανβ3 頭部進(jìn)而活化黏附受體，上調(diào)細(xì)胞遷移黏附效率[31]。目前尚缺乏堿性環(huán)境對骨再生細(xì)胞遷移黏附影響的實驗報道，然而在大鼠皮膚全層創(chuàng)口的愈合研究中發(fā)現(xiàn)：堿性環(huán)境可降低人角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞的遷移活動，亦說明堿性pH 可能對骨缺損區(qū)細(xì)胞遷移有一定影響[32]。

微環(huán)境pH 影響MSCs 與成骨細(xì)胞的增殖能力。Hazehara?Kunitomo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，酸性預(yù)處理（pH6.8）可增強(qiáng)hBMMSCs 表面干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，提高細(xì)胞活力與增殖。Galow等[33]調(diào)節(jié)小鼠前成骨細(xì)胞培養(yǎng)pH 值，發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境（pH8.0～8.4）對其初期增殖也有顯著促進(jìn)作用。然而Li等[34]在鈦表面制備分層微/納米孔膜，發(fā)現(xiàn)堿處理的鈦表面局部pH 升高，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生堿中毒，顯著抑制了BMMSCs 增殖，提示堿性環(huán)境對細(xì)胞增殖有負(fù)面作用。將pH 范圍進(jìn)一步拓寬后發(fā)現(xiàn)，酸性（pH6.3/6.7）與極堿（pH8.5）環(huán)境通過促進(jìn)細(xì)胞衰老顯著抑制hBMMSCs 的增殖能力，而生理（pH7.0/7.4）與弱堿環(huán)境（pH8.0）更有利于細(xì)胞的生存與增殖[35]。

綜上，與過堿環(huán)境相比，生理性和弱堿性的微環(huán)境pH 對骨再生相關(guān)細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用，但酸性環(huán)境對細(xì)胞增殖的影響仍存在爭議。此外，目前關(guān)于微環(huán)境pH 對成骨相關(guān)細(xì)胞遷移、黏附的影響尚無定論，需更多研究以闡明其機(jī)制。

1.3 MSCs成骨向分化、骨基質(zhì)分泌與生物礦化

MSCs遷移黏附至骨缺損區(qū)，在成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子作用下成骨分化，合成堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原和非膠原蛋白，形成有機(jī)骨基質(zhì)，基質(zhì)沉積礦化為羥磷灰石形成新骨。有機(jī)骨基質(zhì)在骨組織中占比約達(dá)30%，主要來源于成熟成骨細(xì)胞，其產(chǎn)量取決于干細(xì)胞成骨分化水平與成骨細(xì)胞的功能活性，二者均受胞外酸堿環(huán)境影響，而與生物礦化相關(guān)的骨礦物鹽沉積和破骨細(xì)胞功能也受微環(huán)境pH作用[36]。

胞外pH 影響干細(xì)胞成骨向分化與成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)蛋白。酸性微環(huán)境不僅抑制MSCs 成骨向分化，也降低成骨細(xì)胞的功能活性。酸性pH 可誘導(dǎo)MSCs 表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白，使其駐留在G0靜止期而不分化為終末細(xì)胞[37]。Tao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，胞外H+可能通過GPR4/cAMP/PKA 通路抑制hBMMSCs 成骨分化。在骨基質(zhì)合成方面，F(xiàn)liefel等[35]認(rèn)為酸性pH 降低hBMMSCs 膠原合成，抑制ECM 合成和ALP活性。體外實驗顯示，胞外pH 由7.5 降至6.6 時，hBMMSCs 的ALP 活 性和 膠原合成數(shù)量下降50%至70%[39]。此外，慢性酸中毒還通過下調(diào)小鼠成骨細(xì)胞基質(zhì)Gla蛋白和骨橋蛋白基因表達(dá)，抑制骨基質(zhì)合成[40]。與酸性環(huán)境不同，堿性環(huán)境可刺激MSCs 與成骨細(xì)胞的功能活性，利于細(xì)胞成骨向分化和基質(zhì)合成。Kato等[41]發(fā)現(xiàn)，弱堿環(huán)境可提高成骨細(xì)胞的分化水平。Flie?fel等[35]認(rèn)為，pH8.0 和8.5 是促進(jìn)hBMMSCs 增殖和成骨向分化的適宜pH。此外，堿性環(huán)境還具有顯著的促骨基質(zhì)合成效果。Bushinsky[42]調(diào)整小鼠顱骨培養(yǎng)環(huán)境模擬堿中毒狀態(tài)（pH＞7.5），堿性pH 在降低小鼠顱骨凈鈣流出量的同時，促進(jìn)成骨細(xì)胞膠原合成。

微環(huán)境pH 除了影響細(xì)胞成骨向分化和骨基質(zhì)合成，還在物理化學(xué)層面和細(xì)胞層面作用于骨基質(zhì)礦化過程。Brandao?Burch等[9]研究發(fā)現(xiàn)，隨pH降低，胞外Ca2+濃度上升，羥磷灰石溶解，這與弱堿性羥磷灰石易溶于酸難溶于堿的特性有關(guān)；胞外H+還通過成骨細(xì)胞OGR1/Gq/11/磷脂酶C/蛋白激酶C 途徑促進(jìn)環(huán)氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）生成，小鼠前成骨細(xì)胞ALP 活性和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量隨pH 降低而顯著下降[43]。骨基質(zhì)礦化除了與鈣鹽的物理化學(xué)沉積有關(guān)，還受破骨細(xì)胞骨吸收影響。破骨細(xì)胞活化后的骨吸收作用對骨生物礦化有負(fù)面效應(yīng)，而胞外H+是破骨細(xì)胞成熟與活化的關(guān)鍵分子。Okito等[44]發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境下小鼠成骨細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體（G protein?coupled receptors，GP?CRs）質(zhì)子傳感器GPR4 活化，激活cAMP/PKA 通路，使成骨細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞支持表型，分泌更多核因子κB 受體活化因子配體（receptor acti?vator of nuclear factor?κB ligand，RANKL）。而胞外H+和RANKL 均可上調(diào)大鼠破骨細(xì)胞內(nèi)破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和活化T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，NFATc1），繼而促進(jìn)RANKL 刺激的NFATc1 核移位，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化[45]。

與酸性環(huán)境不同，堿性pH 可促進(jìn)胞外生物礦化并抑制破骨活化。調(diào)節(jié)小鼠前成骨細(xì)胞培養(yǎng)pH發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外鈣沉積具有pH 依賴性，pH7.4 組直到第21天都無法檢測到鈣鹽沉積，而pH7.8組在21d后可見大量細(xì)胞外鈣[33]。堿處理的鈦植體表面在模擬體液中的表面礦化水平也有明顯提高[46]。類似的研究[35]發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境pH 由7.4 上升至8.0 時，生物礦化程度輕微上升，8.0 時礦化成核中心穩(wěn)定且不溶。但pH 進(jìn)一步上升至8.5 后出現(xiàn)骨礦化不良，這可能與鈣鎂磷酸鹽在堿性環(huán)境下溶解有關(guān)。在骨吸收方面，堿性環(huán)境還可中和H+，干擾前破骨細(xì)胞融合形成多核破骨細(xì)胞的過程，降低破骨細(xì)胞β?葡萄糖醛酸酶釋放，抑制破骨活動，穩(wěn)定骨礦物鹽[11,42]。

1.4 骨缺損區(qū)炎癥反應(yīng)與血管再生

骨缺損區(qū)局部急性炎癥反應(yīng)常由組織創(chuàng)傷或傷口感染引起，該炎癥反應(yīng)常與破骨細(xì)胞激活的骨喪失有關(guān)，然而，成骨微環(huán)境的炎癥改變常常具有兩面性[47]。在大鼠牙槽骨缺損修復(fù)模型中，早期炎癥階段pH 較低，后期礦物沉積階段pH 回升，胞外pH 隨炎癥進(jìn)程而變化[14]。此外，骨缺損早期由于缺氧導(dǎo)致細(xì)胞無氧酵解，產(chǎn)生酸性微環(huán)境。胞外酸性環(huán)境獨立于氧氣，對血管再生有不利影響。酸性pH 抑制大鼠成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)。短期內(nèi)，骨缺損區(qū)血管斷裂引起的氧水平下降可上調(diào)VEGF，但持續(xù)的酸負(fù)荷下調(diào)VEGF表達(dá)，不利于血管再生[48]。

理想狀態(tài)下，骨修復(fù)早期的酸性炎性環(huán)境可募集骨祖細(xì)胞并維持其干性，后期的堿性抗炎微環(huán)境則有利于MSCs 的成骨分化、骨礦物鹽沉積及血管再生[45,49]。

2 調(diào)控成骨微環(huán)境酸堿度以促進(jìn)骨再生修復(fù)

與酸性微環(huán)境促進(jìn)骨質(zhì)吸收相比，堿性微環(huán)境則通過刺激成骨細(xì)胞、抑制破骨細(xì)胞功能促進(jìn)骨質(zhì)形成[12?13]。堿化骨缺損區(qū)的酸性微環(huán)境是改善組織工程骨再生治療的可能方案。人工堿化骨再生微環(huán)境pH 的方法主要包括控制炎癥反應(yīng)減少酸性物質(zhì)生成、促血管生成改善細(xì)胞無氧酵解以及植入堿性材料中和酸性物質(zhì)等。

2.1 抑制骨缺損區(qū)炎癥反應(yīng)

骨創(chuàng)傷區(qū)因感染和組織損傷引起持續(xù)性炎癥反應(yīng)，加劇酸化水平?？刂聘腥竞途植繎?yīng)用抗炎因子均可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)生成，緩解炎癥。Chen等[50]在大鼠牙槽骨炎性缺損中植入人顆粒蛋白前體（human progranulin，hPGRN）搭載的膠原蛋白膜支架，發(fā)現(xiàn)hPGRN 顯著抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF?α）表達(dá)并減少抗酒石 酸酸 性磷 酸酶（tartrate?resistant acid phospha?tase，TRAP）染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量，說明hPGRN 可抑制缺損區(qū)炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞活化。然而炎癥反應(yīng)復(fù)雜、炎癥介質(zhì)多樣，對靶組織影響不可控，且炎癥反應(yīng)與微環(huán)境pH 互為因果，試圖通過抗炎調(diào)節(jié)局部pH 存在一定困難，相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步加強(qiáng)[51]。

2.2 生物活性因子刺激血管重建

生物活性因子刺激血管重建是促進(jìn)血管再生以克服缺氧酸性環(huán)境的主要方式。Du等[52]利用吸附VEGF 的納米羥磷灰石/珊瑚人工骨修復(fù)犬下頜骨缺損，發(fā)現(xiàn)VEGF 可促進(jìn)骨愈合早期血管生成。Zhang等[53]使用明膠支架聯(lián)合編碼缺氧誘導(dǎo)因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）的腺病毒修復(fù)大鼠牙槽骨缺損，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HIF?1α 可有效增強(qiáng)牙槽骨缺損中血管和新骨再生。然而，血管再生較為緩慢（每天100 μm～1 mm），受限于血管向組織工程骨內(nèi)生長的固有障礙，通過恢復(fù)血流灌注以緩解低氧酸性微環(huán)境的進(jìn)程過長，無法滿足組織修復(fù)的時間要求[15]。

2.3 堿性人工骨替代品中和成骨微環(huán)境酸性物質(zhì)

利用堿性材料，創(chuàng)造利于細(xì)胞生存、成骨修復(fù)的弱堿環(huán)境，方法簡便，有一定的成骨效果，是組織工程學(xué)研究的新方向[33]。Shen等[54]制備的新型含鍶硅酸鈣（calcium silicate，CS）植骨材料表面形成的堿性環(huán)境（pH＞8）促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并顯著提高ALP 活性。Liu等[11]在骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)植入β?TCP、CS 以及摻入10%鍶的CS（Sr?CS）材料，與外周血不同，微環(huán)境pH 隨材料種類改變和時間推移而變化。在微環(huán)境pH 較高的組別內(nèi)可觀察到更多新骨形成，破骨樣細(xì)胞延期響應(yīng)及中間磷酸鹽層沉積，植入材料的堿性產(chǎn)物對骨質(zhì)疏松性骨缺損有良好修復(fù)效果。類似的研究使用鎂黃長石修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠骨缺損，與對照組相比，鎂黃長石植入后缺損區(qū)呈弱堿性并一直持續(xù)到第9周，期間可見成骨細(xì)胞活性增加，材料表面形成了與新骨結(jié)合的無機(jī)物中間層，提示其優(yōu)異的骨再生性能[55]。Li等[56]通過水熱處理在純鈦表面制備一系列Mg?Fe 層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）薄膜。調(diào)節(jié)Mg/Fe 比例可控制Mg?Fe LDHs 層間距，賦予其可調(diào)節(jié)的OH-交換能力，形成pH 可控的局部微環(huán)境。體外實驗表明，Mg?Fe LDHs薄膜修飾的鈦表面具有良好的生物相容性和成骨活性，4∶1 的Mg?Fe 比例可為大鼠BMMSCs生長和成骨分化創(chuàng)造適宜的堿性微環(huán)境。

3 小結(jié)與展望

微環(huán)境酸堿度影響骨再生。向堿性方向改變骨缺損區(qū)病理酸性環(huán)境是可能的骨再生療法，堿性材料有望提高生物學(xué)性能，優(yōu)化骨修復(fù)效果。然而，細(xì)胞感應(yīng)胞外pH 變化并對其做出響應(yīng)的機(jī)制尚未闡明，且酸堿度是非常復(fù)雜的病理生理因素，體內(nèi)多種酸堿傳感器和運(yùn)輸系統(tǒng)可在分子、細(xì)胞水平上嚴(yán)格穩(wěn)定pH，揭示pH 相關(guān)信號傳導(dǎo)的特定作用也存在一定困難[57]。未來的研究需進(jìn)一步分析微環(huán)境pH 影響骨再生的機(jī)制所在，為頜面組織工程骨研發(fā)提供更深入的參考依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。