冠心病患者外周血ATG-5、ATG-7水平與冠狀動(dòng)脈病變程度、心率變異性及斑塊易損性的關(guān)系

李巍 李彥明

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475000 1 心內(nèi)科； 2 心電圖科)

脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等都是引起冠心病的重要因素[1]，而巨噬細(xì)胞在其中扮演著十分關(guān)鍵的角色，通過(guò)攝取大量氧化型低密度脂蛋白并向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，釋放大量炎性遞質(zhì)和相關(guān)酶類(lèi)參與動(dòng)脈斑塊的形成[2]。研究顯示，巨噬細(xì)胞自噬在抑制斑塊早期形成、維持斑塊后期穩(wěn)定等方面具有雙重保護(hù)作用[3]。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種程序化降解機(jī)制，上調(diào)自噬相關(guān)基因5(ATG-5)蛋白的表達(dá)后，巨噬細(xì)胞通過(guò)自噬降解胞內(nèi)膽固醇等的能力大大提高，有利于阻止巨噬細(xì)胞泡沫化的發(fā)生[4]。除了ATG-5以外，ATG-7也是激活巨噬細(xì)胞自噬的核心蛋白，可與ATG-5形成復(fù)合物，一方面參與自噬體的形成，另一方面促使微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC-3)轉(zhuǎn)化為成熟的自噬體膜蛋白[5]。因此血清中ATG-5和ATG-7水平是反映細(xì)胞自噬功能的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。本研究通過(guò)探討血清自噬相關(guān)因子ATG-5、ATG-7與冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度、心率變異性(HRV)以及斑塊易損性的關(guān)系，為尋找有臨床應(yīng)用價(jià)值的分子靶點(diǎn)提供新的思路和試驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2018年1月—2019年6月因不明原因胸痛在我院心血管內(nèi)科進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影(CAG)檢查的患者248例，男134例，女114例；年齡33～85歲，平均年齡(64.93±12.34)歲?；颊叻瞎谛牟〉脑\斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。將所有患者分為冠心病組(左冠狀動(dòng)脈的左前降支、右回旋支、右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有1支血管腔狹窄程度≥50%)200例和對(duì)照組(CAG檢查未發(fā)現(xiàn)異常)48例。其中冠心病組又分為穩(wěn)定型心絞痛組(SAP組)125例和急性冠狀動(dòng)脈綜合征組(ACS組)75例。根據(jù)Gensini評(píng)分系統(tǒng)[8]，將冠心病組患者分為輕度病變(Gensini評(píng)分0～30)組94例，中度病變(Gensini評(píng)分31～60)組59例，重度病變(Gensini評(píng)分>60)組47例。所有受檢對(duì)象均排除腦血管疾病、急(慢)性感染、器質(zhì)性心臟病、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝系統(tǒng)疾病以及長(zhǎng)期大量吸煙、飲酒和濫用藥物等。本研究獲我院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，且所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1血清中ATG-5、ATG-7水平檢測(cè) 采集受試者空腹肘靜脈血，ELISA法檢測(cè)血清中ATG-5和ATG-7水平。試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取與ATG-5、ATG-7蛋白的檢測(cè) 采集每位受試者的動(dòng)脈血15 mL，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，然后收集于離心管中，加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取總蛋白。采用Western blot法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7蛋白的表達(dá)水平。ATG-5、ATG-7抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司，按照1∶100比例稀釋。

1.2.3HRV指標(biāo)的檢測(cè) 冠心病患者采用12導(dǎo)動(dòng)態(tài)心電圖儀(TLC5000型，德國(guó)CONTEC公司)進(jìn)行24 h動(dòng)態(tài)心電圖檢查，包括時(shí)閾參數(shù)：全部R-R間期的標(biāo)準(zhǔn)差(SDNN)、正常相鄰每5 min R-R間期均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(SDANN)、正常相鄰R-R間期的均方根值(RMSSD)、正常相鄰間期差值>50 ms的心搏數(shù)占總心搏數(shù)的百分比(pNN50)；頻域參數(shù)為0.14～0.30 Hz低頻(LF)以及0.15～0.40 Hz高頻(HF)，并計(jì)算LF/HF比值。

1.3 血管內(nèi)超聲檢查

采用血管內(nèi)超聲儀(美國(guó)Boston Scientific公司)探查冠心病患者斑塊遠(yuǎn)端、近端圖像，板塊類(lèi)型分為脂質(zhì)性斑塊(低回聲或無(wú)回聲)、纖維性斑塊(回聲強(qiáng)度與外膜組織相似)、鈣化性斑塊(強(qiáng)回聲，伴有斑塊后方聲影)、混合性斑塊(綜合上述多種回聲特征)。若血管腔內(nèi)出現(xiàn)呈層狀、葉狀或閃亮的斑點(diǎn)狀低回聲圖像則判斷為血栓。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組和對(duì)照組血清中ATG-5、ATG-7水平比較

冠心病組患者血清中ATG-5和ATG-7水平顯著高于對(duì)照組，差異有顯著性(Z=17.154、25.845，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組受試對(duì)象血清中ATG-5、ATG-7水平比較[ρ/μg·L-1，M(P25，P75)]

2.2 不同冠狀動(dòng)脈病變程度冠心病患者HRV指標(biāo)及血清中ATG-5、ATG-7表達(dá)的比較

輕度、中度以及重度組患者SDNN、SDANN、RMSSD、pNN50、LF/HF及血清中ATG-5和ATG-7水平比較，差異均具有顯著意義(F/Z=13.261～363.795,P<0.05)。且病變程度越嚴(yán)重，SDNN、SDANN、pNN50以及LF/HF比值越低，同時(shí)血清中ATG-5和ATG-7水平越高。見(jiàn)表2。

2.3 冠心病患者HRV指標(biāo)與血清中ATG-5和ATG-7表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平與SDNN、SDANN、pNN50值呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.489～-0.172，P<0.05)。另外血清中ATG-7水平與RMSSD值也呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.212，P<0.05)。

2.4 SAP組和ACS組患者外周血血清和單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7水平比較

ACS組患者血清中ATG-5以及ATG-7水平明顯高于SAP組患者(Z=11.089～33.127，P<0.05)。ACS組患者單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5和ATG-7水平均明顯低于SAP組患者(t=10.598、15.351，P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5 SAP組患者和ACS組患者血管內(nèi)超聲檢查結(jié)果比較

經(jīng)血管內(nèi)超聲檢查，SAP組患者主要以纖維性斑塊為主，而ACS組患者則以脂質(zhì)性斑塊為主，兩組患者纖維性斑塊、脂質(zhì)性斑塊類(lèi)型比例比較，差異具有顯著意義(χ2=18.949、28.020，P<0.05)。另外ACS組斑塊破裂患者的比例明顯高于SAP組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.049，P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討 論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，其中巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是病變斑塊形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9-11]。因此減少易損斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，增加斑塊的穩(wěn)定性也是目前臨床上治療冠心病的重要目的之一[12]。眾多研究證實(shí)，自噬在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用不可忽視[13-15]。自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和代謝平衡的重要過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全解碼細(xì)胞自噬的整個(gè)過(guò)程，因此關(guān)于自噬與心血管疾病的關(guān)系一直停留在臨床前研究階段，尚未有可靠的研究成果應(yīng)用于臨床。本研究希望能為自噬相關(guān)分子應(yīng)用于臨床提供新的思路。

自噬分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，其中以大自噬研究最為成熟[16]。在病理?xiàng)l件下，一些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等啟動(dòng)自噬過(guò)程[17]。當(dāng)?shù)兔芏戎鞍淄ㄟ^(guò)受體及非受體途徑進(jìn)入內(nèi)皮下后發(fā)生氧化，長(zhǎng)期暴露于氧化低密度脂蛋白環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬明顯增加，同時(shí)激活巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，加重壞死物質(zhì)的產(chǎn)生及繼發(fā)性炎癥反應(yīng)[18-19]。本研究中冠心病組患者血清中自噬相關(guān)因子ATG-5以及ATG-7水平高于對(duì)照組，并且隨著冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的加重，患者血清中ATG-5以及ATG-7水平也隨之增高。

除了根據(jù)Gensini評(píng)分評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變程度以外，HRV也是定量評(píng)估心肌功能和狀態(tài)的重要指標(biāo)[20]，主要用于反應(yīng)自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心功能的調(diào)節(jié)能力以及交感神經(jīng)與迷走神經(jīng)的平衡性。相較于CAG檢查，HRV檢查具有無(wú)創(chuàng)、成本低等優(yōu)勢(shì)，更適用于冠心病早期評(píng)估[21]。本研究結(jié)果顯示，冠心病患者HRV指標(biāo)與冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度和Gensini評(píng)分均有密切相關(guān)性，Pearson相關(guān)性分析顯示，冠心病患者血清中ATG-5以及ATG-7的水平與SDNN、SDANN、pNN50值呈負(fù)關(guān)，與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)。另外血清ATG-7水平與RMSSD值也呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明HRV在一定程度上可反應(yīng)患者冠狀動(dòng)脈病變程度。而且血清中ATG-5、ATG-7水平與心率變異性存在一定的關(guān)聯(lián)，說(shuō)明自噬貫穿于冠心病發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，但是在各個(gè)階段發(fā)揮的作用和具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

表2 不同冠狀動(dòng)脈病變程度患者HRV指標(biāo)、血清中ATG-5和ATG-7水平比較

表3 SAP組和ACS組患者外周血血清和單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7水平比較(ρ/μg·L-1)

表4 SAP組和ACS組患者冠狀動(dòng)脈病變狹窄處斑塊類(lèi)型比較(例(χ/%))

另外本研究結(jié)果亦顯示出，ACS組患者血清中ATG-5、ATG-7水平明顯高于SAP組，但是單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達(dá)水平卻低于SAP組。這可能是由于ACS以不穩(wěn)定性斑塊為主，當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，內(nèi)皮細(xì)胞的自噬性死亡易于發(fā)生斑塊破裂及血栓形成。過(guò)度的平滑肌自噬也會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的自噬性死亡，斑塊中膠原纖維合成減少，從而導(dǎo)致纖維帽變薄，最終增加斑塊的不穩(wěn)定，因而血清中由內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分泌的ATG-5、ATG-7蛋白分子明顯增加[22]。但是巨噬細(xì)胞自噬不足可導(dǎo)致膽固醇流出減少，脂質(zhì)過(guò)載的泡沫細(xì)胞大量凋亡并難以清除，斑塊中脂質(zhì)含量顯著增加，進(jìn)而加重動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定[23]，因此ACS組患者單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達(dá)量明顯降低。

綜上所述，自噬在冠心病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有兩面性，一方面可通過(guò)參與血管內(nèi)皮損傷、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等促進(jìn)冠狀動(dòng)脈病變的加重，同時(shí)還可以通過(guò)抑制單個(gè)核細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成增加斑塊的穩(wěn)定性。本研究也從自噬角度提示血清中ATG-5、ATG-7在冠心病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中都扮演著重要角色，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平越高，病變程度越嚴(yán)重，HRV越低；另外，雖然ACS組患者血清中ATG-5、ATG-7水平高于SAP組患者，但是單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達(dá)卻低于SAP組患者，說(shuō)明在冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平與冠狀動(dòng)脈病變程度以及HRV有一定關(guān)聯(lián)；而單個(gè)核細(xì)胞中ATG-5、ATG-7蛋白表達(dá)降低可能是降低ACS患者斑塊穩(wěn)定性的重要機(jī)制。因此增加單個(gè)核細(xì)胞自噬對(duì)于穩(wěn)定易損斑塊可能有一定的作用，但是由于自噬作用機(jī)制十分復(fù)雜，還需進(jìn)行更進(jìn)一步的研究加以探討。