華北平原農(nóng)田厚包氣帶及含水層反硝化細(xì)菌的分離鑒定及作用機(jī)制研究*

趙會(huì)成，劉夢(mèng)帥，陳帥民，王新珍，王仕琴，胡春勝，劉彬彬，王鳳花**

(1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心/中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省土壤生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050022； 2.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，合理施用氮肥在保障糧食作物穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)中起著重要作用。然而，隨著集約化農(nóng)業(yè)發(fā)展進(jìn)程的加快，過量施用氮肥的現(xiàn)象日益增加，由此引起的土壤硝酸鹽累積、地下水硝酸鹽污染、溫室氣體排放以及土壤酸化等問題日趨嚴(yán)重[1]。華北平原農(nóng)田區(qū)作為我國主要的糧食主產(chǎn)區(qū)之一，氮肥年施用量高達(dá)500 kg(N)·hm-2·a-1[2]，遠(yuǎn)超作物“最適的”氮肥需求量[286 kg(N)·hm-2·a-1][3]。目前，該地區(qū)農(nóng)業(yè)氮肥施用已造成0～12 m 土壤剖面硝酸鹽的大量累積，成為潛在的污染源，最終通過強(qiáng)降雨或灌溉進(jìn)入地下水，造成污染[4]。已有研究表明典型厚包氣帶農(nóng)田區(qū)淺層地下水中硝酸鹽污染超標(biāo)率高達(dá)50%，而深層地下水中硝酸鹽的污染程度也在逐年加劇[5]。因此，如何削減厚包氣帶土壤硝酸鹽污染是集約化農(nóng)田區(qū)面臨的最重要問題。

包氣帶是指地表到地下水之間的非飽和帶，既是土壤硝酸鹽淋失的通道，也是土壤硝酸鹽累積、轉(zhuǎn)化和削減的場所。其中，土壤硝酸鹽自修復(fù)作用是削減厚包氣帶土壤累積硝酸鹽的重要途徑。土壤中的反硝化微生物，可將土壤中累積的硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氣態(tài)產(chǎn)物(N2O、NO 和N2)[6]，又經(jīng)土壤孔隙消散到大氣中，完成厚包氣帶土壤硝酸鹽污染的自修復(fù)過程，是阻控厚包氣帶土壤硝酸鹽淋失的有效途徑。研究表明，反硝化細(xì)菌約占土壤微生物總數(shù)的5%[7]，但并不是所有的反硝化細(xì)菌都具有完全反硝化能力，有些反硝化細(xì)菌在反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生N2O 等中間產(chǎn)物。N2O 會(huì)對(duì)臭氧層造成破壞，是導(dǎo)致全球變暖現(xiàn)象出現(xiàn)的主要溫室氣體之一[8]，它吸收熱量的能力是CO2的300 倍[9]。因此篩選具有完全反硝化能力的菌株，將累積的硝酸鹽最終還原為N2，對(duì)削減包氣帶土壤累積的硝酸鹽具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，國內(nèi)外關(guān)于反硝化微生物的報(bào)道多來自于表層土壤[10-11]，例如王惠芬等[12]通過采集表層3～5 cm 的土壤分離出6 株具有反硝化能力菌株。陳寒玉等[13]從蔬菜大棚表層0～20 cm 的土壤分離出1 株反硝化細(xì)菌并進(jìn)行土壤脫氮效果研究。Falk 等[14]從表層0～10 cm 的土壤篩選出490 株細(xì)菌，其中8株菌株攜帶nirK 功能基因。盡管包氣帶微生物具有提高反硝化活性的潛力，但目前對(duì)厚包氣帶及含水層土壤中反硝化微生物的研究相對(duì)較少。此外，土壤微生物的反硝化過程受土壤含水量、溫度、硝酸鹽濃度以及可利用碳等因素的影響，其中土壤pH對(duì)微生物反硝化過程尤為重要[15]。有研究表明，過量施氮肥會(huì)導(dǎo)致土壤pH 降低，造成土壤N2O 排放速度加快[15-16]。?imek 等[17]研究表明在酸性土壤中反硝化作用生成的N2O/N2的比例高于堿性土壤。

本研究依托中國科學(xué)院欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站，從農(nóng)田包氣帶及含水層土壤中篩選到62 株細(xì)菌。采用16S rRNA 基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定，同時(shí)選取代表性菌株對(duì)其生長和反硝化特性進(jìn)行初步分析，旨在為微生物強(qiáng)化治理厚包氣帶土壤硝酸鹽污染的應(yīng)用提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究依托中國科學(xué)院欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站，該試驗(yàn)站位于河北省石家莊市欒城區(qū)(37°53′N，114°41′E)，海拔50.1 m，屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候，土壤類型以潮褐土為主。長期施氮肥定位試驗(yàn)始于 1997年，供試土壤采集于長期施氮量為600 kg(N)·hm-2·a-1的處理。土壤樣品采集于2016年6月，利用Geoprobe (Geoprobe Model 54D，美國)土壤深層采樣機(jī)鉆取0～150 m 的土壤樣品，根據(jù)土壤質(zhì)地，選取代表性土層進(jìn)行微生物分離。土壤樣品分為13.3～16.0 m (L1)、16.0～20.0 m (L2)、30.2～39.0 m (L3)、44.0～50.0 m (L4)、50.0～54.0 m (L5)、65.0～70.0 m (L6)、70.0～80.0 m (L7)、81.0～91.0 m(L8)、91.0～96.0 m (L9)、107.0～110.0 m (L10)、117.0～120.0 m (L11)、120.0～126.7 m (L12)、129.0～130.3 m (L13)和141.0～150.0 m (L14)共14 個(gè)土層。分別將上述各土壤剖面土柱樣品混勻后裝入自封袋，并置于冰上，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物篩選工作。

1.2 反硝化細(xì)菌的篩選與鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基

固體TSA 培養(yǎng)基[18]： 胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

液體TSB 培養(yǎng)基[18]： 胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

固體LB 培養(yǎng)基： 胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1.0 L。

土壤浸提液培養(yǎng)基： 牛肉膏3.0 g，胰蛋白胨5.0 g，瓊脂15.0 g，土壤浸汁1.0 L。

所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH 至7.2～7.4，121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌。

1.2.2 反硝化細(xì)菌的分離與純化

采用平板稀釋涂布法分離反硝化細(xì)菌： 稱取5.0 g 新鮮土壤加入無菌水20 mL，28 ℃，180 r·min?1搖床振蕩1 h 后，取出靜置。取上清液并用無菌水進(jìn)行稀釋，稀釋梯度為10-2和10-3。將稀釋后的土壤上清液分別涂布在含有 KNO3(2 mmol·L?1)的TSA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和土壤浸提液培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)袋中于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等挑選單菌落，并經(jīng)多次劃線純化后，將純化后的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，采用甘油水溶液(50%)保存于?80 ℃冰箱中。

1.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.1 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)于細(xì)菌16S rRNA 基因的擴(kuò)增，選用細(xì)菌的通用引物對(duì)27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[19]。PCR 擴(kuò)增體系50 μL，包括2×GoldStar-Mix (康為世紀(jì)，北京) 25 μL，正反向引物各 0.5 μL (10 μM)，DNA 模板1 μL，滅菌超純水23 μL。PCR 擴(kuò)增程序如下： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min； 72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程股份有限公司測序完成，測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)，并使用MEGA 4.0[20]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 反硝化功能測定

預(yù)培養(yǎng)階段： 250 mL 三角瓶中加入50 mL 1/10 TSB 液體培養(yǎng)基，分別接種純化后的菌株，接菌量為1 mL。置于磁力攪拌器上，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)10 h 后，采用紫外可見分光光度計(jì)(UV-6100S，上海)測定菌液在 600 nm 處的吸光度值(OD600)，并確保該值小于0.5。

反硝化功能測定： 120 mL 血清瓶中加入50 mL 1/10 TSB 培養(yǎng)基(含KNO32 mmol·L?1)，使用丁基膠塞和中空鋁蓋進(jìn)行密封。利用真空抽洗氣裝置將血清瓶內(nèi)的空氣置換為氦氣，并添加 1%的氧氣，加快反硝化細(xì)菌的增殖速度。按照吸光值×接種量=0.5 的原則，將菌液接種于血清瓶內(nèi)，立即將血清瓶置于氣體自動(dòng)采樣培養(yǎng)裝置[21]，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)，采用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定血清瓶內(nèi)的N2O 和N2的濃度，每隔2 h進(jìn)行一次采樣。

1.3.3 形態(tài)特征檢測

細(xì)菌電鏡照片采用逐點(diǎn)成像的方法，將樣品圖像特征按順序成比例的轉(zhuǎn)化為圖像信號(hào)。具體過程為預(yù)先向培養(yǎng)皿中放入尺寸大小不同的蓋玻片，加入適量TSB 液體培養(yǎng)基并接種目的菌種，密封后28 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。移液器緩緩移除菌液，只保留蓋玻片和菌團(tuán)，加入10 mL PBS 溶液(NaCl 8 g·L?1； KCl 0.2 g·L?1； Na2HPO41.44 g·L?1； KH2PO40.24 g·L?1，pH 7.4)清洗菌體。加15 mL 戊二醛溶液(2.5%)進(jìn)行室溫避光固定。再用乙醇脫水后，即刻用臨界點(diǎn)干燥儀(Leika EM CPD300，德國)干燥1.5 h。最后將干燥后的蓋玻片固定在銅臺(tái)，使用真空鍍膜儀(Leika EM SCD050，德國)噴金處理后置于掃描電鏡(Phenom ProX，荷蘭)的樣品臺(tái)模塊，按照高倍聚焦、低倍成像的順序進(jìn)行觀察并拍照保存。

1.3.4 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢測

采用半固體穿刺法對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行檢測。50 mL離心管中加入45 mL 半固體培養(yǎng)基，滅菌牙簽蘸取菌液后，刺入半固體培養(yǎng)基中，拔出牙簽，過夜培養(yǎng)。使用透射光源目測的方式觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，若觀察到細(xì)菌僅生長在穿刺線上，且存在明顯的邊緣界限，則表示細(xì)菌不具有運(yùn)動(dòng)特性； 反之，若觀察到細(xì)菌沿著穿刺線向其四周生長擴(kuò)散并呈現(xiàn)云霧狀，則表示細(xì)菌具有運(yùn)動(dòng)性。

1.4 pH 對(duì)反硝化細(xì)菌功能的影響

120 mL 血清瓶中加入50 mL 1/10 TSB 培養(yǎng)基，添加KNO3終濃度為2 mmol·L?1，分別通過磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 為5.8、6.2、6.6、7.0、7.4 和7.8，接種具有完全反硝化能力的菌株L103，接菌量為1 mL，將血清瓶置于氣體自動(dòng)采樣培養(yǎng)裝置[21]，700 r·min?1，28 ℃恒溫培養(yǎng)，使用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定血清瓶內(nèi)的N2O和N2的濃度，每隔2 h進(jìn)行一次采樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化的反硝化菌株

本試驗(yàn)共篩選得到 62 株潛在的反硝化菌株，16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖1 所示，篩選到的 6 2 株菌株分別與變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)中的 9 個(gè)屬，即與不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter，35 株)、假單胞菌屬(Pseudomonas，15株)、陰溝腸桿菌屬(Enterobacter，3 株)、叢毛單胞菌屬(Comamonas，3 株)、微球菌屬(Micrococcus，2 株)、芽孢桿菌屬(Bacillus，1 株)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus，1 株)、副球菌屬(Paracoccus，1 株)以及氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga，1 株)具有較高的同源性。根據(jù)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，挑選其中7株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株(L37、L71、L96、L103、L104、L133 和L13)進(jìn)行后續(xù)反硝化功能研究。

2.2 細(xì)菌反硝化功能驗(yàn)證

選取菌株L37、L71、L96、L103、L104、L133和L13 進(jìn)行反硝化功能試驗(yàn)。結(jié)果表明，在厭氧條件下，菌株L37、L96、L104 和L133 均不能產(chǎn)生N2O和N2，初步推測這些菌株不具備反硝化能力。菌株L71、L13 和L103 具有反硝化功能(圖2)。其中菌株L71 在第4 h 開始產(chǎn)生N2O，N2O 產(chǎn)生速率從第8 h開始勻速增長，第18 h 反應(yīng)結(jié)束。菌株L13 在第3 h開始產(chǎn)生N2O，N2O 產(chǎn)生速率從第5 h 開始勻速增長，第8 h 反應(yīng)結(jié)束。此外，菌株L103 是唯一能夠在反硝化過程中產(chǎn)生N2的反硝化細(xì)菌，從第4 h 開始產(chǎn)生N2O，第9 h 達(dá)峰值，隨后N2O 濃度迅速下降，到第10 h N2O 濃度為0； 而N2在第7 h 開始產(chǎn)生，第10 h N2產(chǎn)量達(dá)峰值。結(jié)果表明，菌株L103 具備完全反硝化能力，經(jīng)計(jì)算得到其反硝化速率高達(dá)1.62～2.36 g(KNO3)·d?1·L?1。

2.3 反硝化細(xì)菌的形態(tài)特征及生物學(xué)特性

電鏡觀察結(jié)果表明，反硝化菌株L71、L13 和L103 均為桿狀細(xì)菌，長度分別為1.0 μm、1.5 μm 和1.5 μm，且都不具有鞭毛(圖3)。菌株運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，菌株L71 和L13 僅在穿刺物的位置上生長，與半固體培養(yǎng)基存在明顯界限，說明菌株L71 和L13 沒有運(yùn)動(dòng)能力。而菌株L103 則沿著穿刺物中心向其四周呈現(xiàn)云霧狀擴(kuò)散，與培養(yǎng)基界限不明顯，表明菌株L103 具有運(yùn)動(dòng)能力。

表1 菌株L71、L13 和L103 的生物學(xué)特性Table 1 Biological features of the selected strains L71，L13 and L103

2.4 pH 對(duì)細(xì)菌L103 反硝化功能的影響

菌株L103 在pH 5.8、6.2、6.6、7.0、7.4 和7.8條件下的反硝化功能結(jié)果如表2 所示。在pH 7.8 條件下反硝化速率最大，最大反硝化速率隨著pH 的降低而降低。在pH 6.2 和pH 5.8 條件下菌株L103的反硝化活性受到抑制。因此挑選pH 6.6 和pH 7.4條件下，添加1%的氧氣，進(jìn)一步探究菌株L103 在反硝化過程中NO、N2O、N2和O2的變化情況(圖4)。結(jié)果表明，在pH 7.4 的條件下，O2在第12 h 時(shí)完全耗盡，第6 h 開始產(chǎn)生NO、N2O 和N2。NO 在第8 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后NO 濃度降低，到第10 h，濃度降為0。N2O 在第10 h 達(dá)到峰值，之后濃度降低，在第12 h 時(shí)產(chǎn)量為0。而N2在第8 h 產(chǎn)生速率逐漸加快，之后保持穩(wěn)定，直到第12 h 時(shí)濃度不再增加。在pH 6.6 的條件下，O2在第20 h 時(shí)完全耗盡，NO 的峰值出現(xiàn)在第28 h。N2O 則在第10 h 和第45 h 出現(xiàn)峰值，最大峰值出現(xiàn)在第45 h，之后濃度快速下降，到第55 h時(shí)濃度為0。N2則是在第28 h 時(shí)才開始產(chǎn)生，并在第58 h 時(shí)達(dá)到峰值。上述結(jié)果可以表明，與pH 7.4 相比，菌株在pH 6.6 的條件下反硝化活性受到抑制。

表2 菌株L103 在不同pH 下將KNO3 還原成N2 所需時(shí)間及最大反硝化速率Table 2 Time consumed to reduce KNO3 to N2 and max denitrification rate of the strain L103 at different pH

3 討論和結(jié)論

本研究從華北平原長期施氮肥的農(nóng)田厚包氣帶土壤及含水層中共篩選到62 株潛在的反硝化細(xì)菌，測序結(jié)果表明這62 株菌株分別與變形菌門、放線菌門、厚壁菌門中的9 個(gè)屬具有較高的同源性。深層包氣帶土壤中環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)與表層土壤存在很大差異[22]。盡管表層土壤中人為施肥、動(dòng)植物殘?bào)w的分解、根系分泌物的產(chǎn)生等因素，使得表層土壤中富含微生物所需的有機(jī)碳等營養(yǎng)元素，但由于土壤吸附、微生物分解以及作物根系吸收等，表層土壤中富含的養(yǎng)分很難進(jìn)入深層土壤中，這就導(dǎo)致深層土壤環(huán)境變得更為貧瘠，微生物豐度和多樣性也變得很低。研究表明，變形菌門在各種土壤環(huán)境中占主導(dǎo)地位，包括養(yǎng)分受限的環(huán)境[22]； 厚壁菌門能夠產(chǎn)生孢子，可抵御惡劣的環(huán)境條件[23-24]。此外發(fā)現(xiàn)篩選到的這62 株菌株中，35 株菌株和15株菌株分別與不動(dòng)桿菌屬及假單胞菌屬具有很高的同源性，這與不動(dòng)桿菌屬[24]和假單胞菌屬[22]在反硝化過程中起關(guān)鍵作用的報(bào)道一致。Chen 等[22]通過反硝化潛勢的測定以及反硝化功能基因的定量試驗(yàn)也證實(shí)了包氣帶土壤中反硝化微生物的存在。

集約化農(nóng)田往往依靠施加大量氮肥和灌溉來提高作物產(chǎn)量，未被植物利用的氮素會(huì)在土壤中累積，進(jìn)而通過淋溶進(jìn)入到地下水，對(duì)地下水水質(zhì)安全造成威脅[25]。而深層土壤中存在的反硝化微生物可通過微生物的反硝化過程，完成土壤硝酸鹽的自修復(fù)，對(duì)削減深層包氣帶土壤累積的硝酸鹽、保障地下水安全具有重要的作用。同時(shí)，包氣帶土壤微生物的反硝化作用受到多種因素的影響，比如反硝化微生物的豐度及土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮和氧氣含量等。其中，土壤有機(jī)碳是驅(qū)動(dòng)反硝化作用進(jìn)行的能源物質(zhì)，決定了土壤中反硝化作用的強(qiáng)弱，是限制深層土壤反硝化作用的關(guān)鍵因素[22]。此外，自然界中并不是所有的反硝化細(xì)菌都具有完全反硝化能力，土壤中存在完全和不完全反硝化細(xì)菌[26]，這些不完全反硝化細(xì)菌在反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生NO、N2O 等中間產(chǎn)物，是環(huán)境中N2O 主要的排放源[27-28]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，菌株L71 和L13 是不完全反硝化菌株，只能將硝酸鹽底物還原為N2O。只有菌株L103 能夠進(jìn)行完全反硝化能力，可以將硝酸鹽底物完全還原為N2，其反硝化速率高達(dá)1.62～2.36 g (KNO3)·d?1·L?1，具備實(shí)際應(yīng)用潛力。進(jìn)一步根據(jù)菌株L103 的全基因組測序結(jié)果表明，該菌株含有反硝化過程的4 個(gè)步驟所必需的4 種反硝化功能基因[29]，此結(jié)果與細(xì)菌的反硝化潛勢測定結(jié)果相吻合。

與此同時(shí)，長期施氮肥引起的土壤酸化問題也日益嚴(yán)重[30]。土壤酸化會(huì)加快農(nóng)田土壤N2O 的排放速度，加劇溫室氣體的影響[15-17]。本試驗(yàn)中菌株L103 在不同pH 條件下反硝化潛勢的結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中菌株L103 的反硝化過程受到pH 的影響，低pH 影響反硝化速率，尤其是N2O 還原為N2的速率。有研究發(fā)現(xiàn)氮相關(guān)功能微生物比較適宜生存在中性或弱堿性環(huán)境中[31]。也有研究表明土壤pH 可影響反硝化酶Nos 的活性，當(dāng)pH>7 時(shí)，反硝化酶Nos 的活性增強(qiáng)，而當(dāng)pH<7 時(shí)，反硝化酶Nos 的活性降低，而其他反硝化酶活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致反硝化過程產(chǎn)生更多的N2O[32]。

綜上所述，本研究結(jié)果對(duì)理解微生物在土壤硝酸鹽污染反硝化自修復(fù)過程中的作用機(jī)制、利用微生物資源增強(qiáng)包氣帶土壤硝酸鹽污染的自修復(fù)過程，從而削減農(nóng)田土壤硝酸鹽積累具有重要的指導(dǎo)意義。但目前對(duì)于反硝化細(xì)菌的實(shí)際應(yīng)用還處于探索階段，更多的機(jī)制和高效反硝化細(xì)菌的工程應(yīng)用尚待深入研究。