酵母重組表達(dá)PCV2病毒樣顆粒的純化工藝

謝 晉，楊德強(qiáng)，周峻崗，李翊峰，呂 紅

(1.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2.無(wú)錫藥明生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 214092；3.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438；4.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為已知最小的感染哺乳動(dòng)物病毒，包含一個(gè)循環(huán)的單鏈DNA基因組.豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起5～12周齡的斷奶仔豬發(fā)生多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-Weaning Multisy-stemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原.通常該病在養(yǎng)豬場(chǎng)的發(fā)病率為20%～60%，死亡率約為5%～35%[1].PCV2相關(guān)的疾病正嚴(yán)重影響產(chǎn)豬國(guó)家的經(jīng)濟(jì)[2].

PCV2病毒顆粒是一個(gè)直徑約20nm的20面體且為非包膜結(jié)構(gòu)[3].PCV2的開(kāi)放閱讀框區(qū)域2(Open Reading Frame 2,ORF2)編碼一個(gè)約30kDa左右的病毒衣殼蛋白Cap[4].病毒樣顆粒(Virus-Like Particles,VLPs)是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的與病毒顆粒類(lèi)似的結(jié)構(gòu)顆粒，但不含病毒核酸，不能進(jìn)行自主復(fù)制.PCV2病毒VLPs由衣殼蛋白Cap組裝而成，其與完整的PCV2顆粒相似，可作為一種重要的PCV2免疫原.用其制備的VLPs疫苗可誘導(dǎo)豬免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵抗PMWS的保護(hù)機(jī)制[5-6]，且免疫原性良好[7-8].鑒于VLPs與天然病毒結(jié)構(gòu)的相似性、無(wú)感染性、良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、出色的免疫原性以及良好的結(jié)構(gòu)可塑性、獨(dú)特的承載DNA及其他分子的能力，VLPs相關(guān)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、新型疫苗開(kāi)發(fā)、新型藥物遞送載體開(kāi)發(fā)及基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[1].

目前，PCV2 Cap VLPs的純化通常采用氯化銫或蔗糖超速離心法[9-12].但在大規(guī)模純化生產(chǎn)中，超速離心法將會(huì)隨著規(guī)模的擴(kuò)大受限于硬件以及勞動(dòng)強(qiáng)度的增加[13-14].色譜層析分離方法，包括離子交換層析[17-19]、疏水相互作用層析[18,20]、羥基磷灰石層析[19]等，被認(rèn)為是一種可替代氯化銫或蔗糖超速離心法的純化方案，廣泛應(yīng)用于病毒和VLPs的純化.但在應(yīng)用于純化酵母胞內(nèi)表達(dá)的VLPs時(shí)，酵母破碎之后樣品中含有大量的細(xì)胞碎片(其主要成分包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、多磷酸脂類(lèi)和核酸等[21])，限制了該方法的使用.通過(guò)離心的方式可以有效分離大片段的細(xì)胞碎片，但仍然有微小的細(xì)胞碎片懸浮于上清之中形成混合液，表現(xiàn)為離心上清濁度較高，VLPs的得率較低，容易造成層析柱的堵塞并且增加層析柱清潔處理的難度從而影響層析填料的使用壽命[21].Mindaugas等學(xué)者研究表明，酵母表達(dá)PCV2 Cap蛋白使用Q Sepharose XL填料作為第一步層析可去除部分宿主細(xì)胞蛋白及殘留DNA，第二步層析采用陽(yáng)離子層析可進(jìn)一步去除雜質(zhì)，即使在比較好的條件下使用CIMmultus SO3填料純化也只能得到純度約為40%的PCV2 Cap VLPs蛋白，收率為15%～18%[22].目前可用的澄清方法有物理過(guò)濾和化學(xué)處理：物理過(guò)濾主要包括深層過(guò)濾和中空纖維過(guò)濾等方式；化學(xué)處理包括酶降解、有機(jī)溶劑/表面活性劑處理等方法.

本研究通過(guò)考察中空纖維過(guò)濾、酶降解和有機(jī)溶劑/表面活性劑作用等方法的澄清效果，建立起一套新的澄清方法以解決純化過(guò)程中破碎后菌液濁度過(guò)高的問(wèn)題.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組PCV Cap蛋白馬克斯克魯維酵母KM-PCV2(K.marxianusFim-1ura3Δ/pUKDN125-Cap)為本實(shí)驗(yàn)室保存[23].

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲細(xì)胞破碎儀(JY92-ⅡN)，寧波新芝生物科技股份有限公司；FastPrep-24均質(zhì)破碎儀,美國(guó)MP公司；JN3000高壓均質(zhì)機(jī)，Jnbio廣州聚能納米生物科技有限公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA purify100，美國(guó)GE healthcare公司；Talos L120C透射電子顯微鏡，美國(guó)Thermo fisher公司；低溫離心機(jī)CF15RN，Hitach日立株式會(huì)社；1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫公司.

1.1.3 主要試劑

Triton X-100購(gòu)自Life Sciences公司,SP Bestarose FF填料購(gòu)自博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司；酸洗玻璃珠(200μm)購(gòu)自Sigma公司；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司，均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 酵母細(xì)胞破碎

KM-PCV2菌株發(fā)酵制備方法參照文獻(xiàn)[23]，發(fā)酵液5000r/min離心10min收集酵母細(xì)胞，用磷酸緩沖液(50mmol/L Na2HPO4,100mmol/L NaCl,pH 6.8)進(jìn)行重懸.酵母細(xì)胞超聲波破碎采用寧波新芝超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，取1mL酵母細(xì)胞重懸液，調(diào)節(jié)功率54%(350kW)，總工作時(shí)間25min，工作時(shí)間3s/次，間歇5s.玻璃珠研磨破碎采用MP FastPrep-24破碎儀，取0.5mL酵母細(xì)胞重懸液，加入約0.2mL酸洗玻璃珠，轉(zhuǎn)速5.5m/s，工作時(shí)間60s.高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體，溫度4℃，壓力1100～1600bar.將破碎后的菌液稀釋至合適的濃度，取0.1mL系列稀釋后樣品均勻涂在酵母培養(yǎng)基YEPD平板上，30℃培養(yǎng)2d計(jì)數(shù)形成菌落數(shù)，計(jì)算該菌落數(shù)與菌液破碎前菌落數(shù)的比值，用此數(shù)值表示細(xì)胞的破碎率.酵母細(xì)胞破碎液經(jīng)10000g離心30min后，上清和沉淀樣品與5×SDS-PAGE Loading buffer(250mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),10% SDS,0.5%溴酚藍(lán),50%甘油，5% β-巰基乙醇)混勻后放入沸水加熱10min，待冷卻后每孔加入準(zhǔn)備好的樣品20μL或Page ruler預(yù)染蛋白Marker 7μL，以純化PCV2 Cap蛋白作為參照，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)PCV2 Cap蛋白，對(duì)電泳凝膠掃描圖采樣的背景灰度值與純化Cap蛋白灰度值進(jìn)行對(duì)比，從而相對(duì)定量PCV2 Cap的蛋白濃度.

1.2.2 酵母細(xì)胞破碎液的澄清

離心后獲得的上清液分別加入0.1%～1%(體積分?jǐn)?shù))的有機(jī)溶劑(甲醛、乙醇、乙酸乙酯、氯仿)、表面活性劑(聚山梨酯-80 Tween 80、聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100、十二烷基硫酸鈉SDS、十六烷基三甲基溴化銨CTAB)和化學(xué)試劑(硫酸鎂和硫酸鋅)等，30℃處理2h后10000g離心30min，使用HACH 2100Q便攜式濁度儀檢測(cè)處理前后的濁度，以散射濁度單位NTU(Nephelometric Turbidity Unit)表示溶液中懸浮物的量，1NTU相當(dāng)于1L的水中含有1mg的SiO2(或是白陶土、硅藻土懸浮體)時(shí)所產(chǎn)生的渾濁程度.而處理后上清液和沉淀中PCV2 Cap蛋白的濃度則采用上述的電泳凝膠掃描方法定量.

1.2.3 PCV2 VLPs的離子交換層析

離子交換層析采用裝填了400mL SP Bestarose FF填料的XK 50/30柱.層析柱用平衡液(50mmol/L Na2HPO4,100mmol/L NaCl,pH 6.8)平衡，然后將離心澄清的上清液以2.6mL/min速率上樣.上樣結(jié)束后用平衡液沖洗至基線(xiàn)平穩(wěn)，然后用洗脫液(50mmol/L Na2HPO4,1mol/L NaCl,pH 6.8)洗脫P(yáng)CV2 VLPs.

1.2.4 PCV2 VLPs的HPLC檢測(cè)

HPLC流動(dòng)相為100mmol/L NaH2PO4，100mmol/L Na2SO4，pH 6.7，流速為0.6mL/min.色譜柱采用東曹公司的TSKgel G4000 SWXL column(300mm×7.8mm i.d.)，保護(hù)柱為T(mén)SKgel SWXL(40.0mm×6.0mm i.d.).上樣100μL進(jìn)樣，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，采用峰面積積分法計(jì)算PCV2 VLPs的純度.

1.2.5 PCV2 VLPs的電子顯微鏡檢測(cè)

取5μL樣品點(diǎn)在銅網(wǎng)上，室溫吸附5min后，用濾紙吸干液體，然后滴加3%磷鎢酸染液進(jìn)行負(fù)染，用濾紙吸去多余的染液，放置在烤燈下.制好的片子置于透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)為120k倍.

2 結(jié) 果

2.1 KM酵母表達(dá)PCV2 Cap蛋白的發(fā)酵液細(xì)胞破碎條件優(yōu)化

采取超聲波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高壓均質(zhì)破碎3種方法對(duì)KMPCV2 Cap酵母細(xì)胞進(jìn)行了破碎，比較了破碎前后的菌懸液在YEPD平板上的克隆形成數(shù)反應(yīng)細(xì)胞破碎率，結(jié)果如圖1所示，表明3種破碎方法均能達(dá)到98%以上的細(xì)胞破碎率.采用高壓均質(zhì)破碎酵母細(xì)胞時(shí)，隨著壓力的升高細(xì)胞的破碎率有顯著提升.為了檢測(cè)不用破碎方法獲得的PCV Cap蛋白的量，我們進(jìn)一步用SDS-PAGE檢測(cè)了細(xì)胞破碎后離心收集的上清和沉淀中PCV2 Cap蛋白的量，以純化獲得的Cap蛋白作為參比，通過(guò)灰度掃描的方法，確定破碎后上清中PCV2 Cap蛋白的得率(用上清的數(shù)值/上清加沉淀的數(shù)值計(jì)算得率，用百分比表示).結(jié)果(圖2，見(jiàn)第688頁(yè))發(fā)現(xiàn)超聲波破碎上清PCV2 Cap蛋白偏低，僅為18.9%，而玻璃珠研磨破碎和1300bar高壓均質(zhì)破碎2次的效果最佳，上清中的Cap蛋白得率分別達(dá)到64.8%和64.6%.但由于玻璃珠研磨破碎在工業(yè)應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)工藝的放大，因此在后續(xù)工藝優(yōu)化中采用在1300bar高壓均質(zhì)破碎2次的方法進(jìn)行重組酵母細(xì)胞的破碎.

2.2 添加不同試劑對(duì)酵母細(xì)胞破碎液澄清的影響

KM-PCV2重組酵母細(xì)胞高壓均質(zhì)破碎后濁度較高，即使12000r/min離心20min后濁度依然高于600NTU，為了減少對(duì)離子交換層析純化的影響，本研究采用了在酵母細(xì)胞破碎液添加一定量有機(jī)溶劑(甲醛、乙醇、乙酸乙酯、氯仿)、表面活性劑(PS80、Triton X-100、SDS、CTAB)和化學(xué)試劑(無(wú)水硫酸鎂和七水硫酸鋅)進(jìn)行處理，然后離心澄清比較處理前后的濁度變化，結(jié)果如圖3所示.添加0.5% Triton X-100和1%氯仿可以顯著降低酵母細(xì)胞破碎液的濁度，分別達(dá)37%和42%.

進(jìn)一步比較了不同的氯仿或Triton X-100添加量降低酵母細(xì)胞破碎液濁度的效果，結(jié)果表明酵母破碎液中加入1%氯仿的澄清效果最佳，破碎液濁度降低約35%(圖4(a)).與氯仿相比，添加Triton X-100后破碎液的澄清效果更好，添加了0.1% Triton X-100處理后離心獲得的澄清液濁度降低約80%(圖4(b))，隨著Triton X-100添加濃度的增加，澄清液的濁度呈緩慢下降趨勢(shì)，Cap蛋白的得率則有所提高.

為了測(cè)試Triton X-100對(duì)高濁度酵母細(xì)胞破碎液的澄清效果，我們將KM-PCV2菌株的發(fā)酵液不經(jīng)離心處理，直接采用1300bar高壓均質(zhì)破碎2次獲得含Cap蛋白的破碎液，其濁度為3500～4000NTU，分別加入0.1%～2% Triton X-100處理2h后離心收集上清后測(cè)定濁度和Cap蛋白的含量，結(jié)果如圖5所示.加入1% Triton X-100的濁度能夠降低65%以上，并且上清中的Cap蛋白的得率高于90%，說(shuō)明Triton X-100對(duì)高濁度酵母細(xì)胞破碎液也有很好的澄清效果.

2.3 Triton X-100澄清處理對(duì)離子交換層析純化PCV2 VLPs的影響

PCV2重組菌細(xì)胞破碎液用1% Triton X-100處理后，使用陽(yáng)離子SP Bestarose Fast Flow介質(zhì)進(jìn)行層析分離純化，并與未添加Triton X-100的樣品作為對(duì)比，比較Triton X-100澄清處理對(duì)PCV2 VLPs的純度、得率和濁度的影響，結(jié)果如表1(見(jiàn)第690頁(yè))所示.采用Triton X-100澄清處理后的進(jìn)行離子交換層析純化獲得的PCV2 VLPs的得率、純度和澄清度等均優(yōu)于未作處理組.其中PCV2 VLPs的純化得率提高2.1%，純度提高3.8%，濁度降低82.6%，表明Triton X-100澄清處理能顯著提高含PCV2 VLPs上清液的澄清效果.Triton X-100處理前后樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6.

表1 Triton X-100澄清處理前后的PCV2 VLPs IEC純化得率、濁度和純度Tab.1 The recovery rates,turbidities and purities of PCV2 VLPs by ion exchange chromatography

SDS-PAGE檢測(cè)IEC上樣流穿液中并未發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白(圖6(a)泳道5，6).采用高效液相色譜進(jìn)行IEC純化的VLPs純度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)添加1% Triton X-100澄清處理后的保留時(shí)間10min的峰高顯著低于未處理的樣品，而它的分子量又明顯大于PCV2 VLPs的分子量(PCV2 VLPs保留時(shí)間約15min，分子量約1600kDa)，表明該物質(zhì)可能是影響濁度的大分子細(xì)胞碎片(圖6(b)).

PCV2 VLPs是由60聚體Cap蛋白組成的病毒樣顆粒，為了檢測(cè)Triton X-100處理是否會(huì)影響PCV2 VLPs粒子的構(gòu)象，我們將IEC純化獲得的樣品用透射電子顯微鏡觀察VLPs的形態(tài)，結(jié)果如圖7所示，表明1% Triton X-100處理的純化工藝樣品與未進(jìn)行Triton X-100處理的樣品形態(tài)基本一致，并且很好地維持VLPs的狀態(tài)，沒(méi)有明顯的聚集或其他異?，F(xiàn)象.

3 討 論

酵母細(xì)胞破碎可采用機(jī)械破碎和非機(jī)械破碎[46]，機(jī)械破碎包括超聲波破碎(Ultrasonication,US)、珠磨破碎(Bead Mill)和高壓均質(zhì)破碎(High Pressure Homogenization，HPH)，但高強(qiáng)度的超聲波破碎會(huì)導(dǎo)致生物活性的喪失[24].珠磨破碎易破壞蛋白活性且回收率低，易形成極細(xì)的細(xì)胞碎片增加后續(xù)純化的難度[25]，高壓均質(zhì)破碎常常作為酵母和細(xì)菌的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備被用于制藥和生物技術(shù)工廠[26-27].非機(jī)械細(xì)胞破碎包括電解、酶解、化學(xué)和物理方法，電解法易于破壞外膜，但是內(nèi)膜卻很難被破壞[28]，需要與其他的破碎方式聯(lián)用，而酶解法的高成本是制約其工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的重要因素[29].物理破碎法如降壓法(Decompression)[30-31]一般會(huì)產(chǎn)生大片段細(xì)胞碎片有利于后續(xù)純化工藝，但是在實(shí)際應(yīng)用中由于有限性、通用性和效率低未被廣泛應(yīng)用.化學(xué)破碎一般會(huì)引入外源化學(xué)物造成下游工藝的復(fù)雜度，且高濃度的化學(xué)試劑會(huì)導(dǎo)致蛋白變性或失活，也未被廣泛應(yīng)用[22].本研究比較了超聲波破碎、珠磨破碎和高壓均質(zhì)破碎進(jìn)行KM-PCV2酵母細(xì)胞的破碎，發(fā)現(xiàn)超聲波破碎上清與沉淀中的蛋白比率很明顯偏低，但未能破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜釋放VLPs，而珠磨破碎和高壓均質(zhì)破碎均有獲得較高產(chǎn)量的VLPs釋放，但考慮到工藝的放大實(shí)施，KM-PCV2酵母細(xì)胞的破碎采用高壓均質(zhì)破碎.

利用酵母生產(chǎn)病毒樣顆粒疫苗時(shí)進(jìn)行細(xì)胞破碎釋放VLPs，但在高壓破碎后產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，通過(guò)離心澄清仍然留有微小片段的細(xì)胞碎片懸浮于上清之中形成混濁液，易堵塞層析柱并影響層析填料使用壽命[22].本研究通過(guò)對(duì)比多種可用的澄清方法，包括深層過(guò)濾和中空纖維過(guò)濾等通過(guò)膜孔徑大小截留的物理分離方式，以及酶降解、有機(jī)溶劑/表面活性劑處理等化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)Triton X-100處理可以有效降低破碎后離心上清液的濁度.Triton X-100是一種典型的非離子型表面活性劑，包含一個(gè)芳香基團(tuán)、一個(gè)聚氧乙烯親水鏈和一個(gè)疏水的烴鏈.Triton X-100分子在溶液中且非常低的濃度狀態(tài)下會(huì)形成膠束[32-34]，這種膠束被廣泛用于增加活細(xì)胞膜的透性[35-37]，從溶解產(chǎn)物中提取蛋白和細(xì)胞器，溶解或穩(wěn)固生物膜的組分或蛋白[38-41].Triton X-100有能力重排多相性溶液中的脂類(lèi)混合物[39]，從而影響脂類(lèi)物質(zhì)在溶液中的分布.Ribeiro等報(bào)道了一些脂類(lèi)物質(zhì)可以與Triton X-100形成難溶的溶膠[42]，從而可以通過(guò)離心方式予于分離[43-44].這些Triton X-100難溶的脂類(lèi)物質(zhì)包括DIG(Detergent-Insoluble Glycolipid)、TIFF(Triton-Insoluble Floating Fraction)、GEM(Glycolipid Enriched Membranes)以及富含鞘磷脂和膽固醇區(qū)域的胞膜[45-48].在KM-PCV2細(xì)胞破碎液用Triton X-100澄清處理前濁度很高，加入Triton X-100離心可以發(fā)現(xiàn)有新的固定沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明在Triton X-100的作用下微小的細(xì)胞碎片聚集成更大顆粒從而可以離心分離，與之前的研究報(bào)道相一致.

自1998年發(fā)現(xiàn)PCV2病毒以來(lái)，這種無(wú)包膜的環(huán)狀DNA病毒被全球認(rèn)為是豬群中最重要的病原體之一，每年都給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失，每年的疫苗需求量日益增加.2003年豬圓環(huán)病毒從2a型進(jìn)化到2b型，而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)2d型已經(jīng)成為流行性毒株，可見(jiàn)PCV2病毒進(jìn)化率的頻率非常之高.目前商業(yè)化的疫苗集中為治療PCV2a和2b兩個(gè)基因型，因而對(duì)縮短PCV2的研發(fā)周期和生產(chǎn)工藝成熟穩(wěn)定且成本低易于商業(yè)化實(shí)施要求越來(lái)越強(qiáng)烈.在PCV2的疫苗制備的多種表達(dá)體系中，酵母表達(dá)體系在各方面均展現(xiàn)良好的發(fā)展前景，然而酵母生產(chǎn)PCV2疫苗的工藝包括細(xì)胞破碎、澄清以及層析純化，其中適用于工業(yè)生產(chǎn)的破碎工藝以及破碎雜質(zhì)的分離成為純化工藝難點(diǎn).本研究針對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎(1300bar高壓，破碎兩次)以及破碎樣品分離(細(xì)胞破碎液用1% Triton X-100處理)進(jìn)行了研究，提供了有效降低破碎后中間產(chǎn)品濁度的方案，使用陽(yáng)離子SP Bestarose Fast Flow層析分離，得率在92%以上和HPLC純度在85%以上，為酵母表達(dá)豬圓環(huán)病毒類(lèi)病毒顆粒疫苗提取純化工藝以及工業(yè)化批量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).