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    響應(yīng)曲面法優(yōu)化蒺藜中黃酮和皂苷的提取工藝*

    2021-01-12 07:20:46譚健聰楊鈺蓉劉春葉
    化工科技 2020年6期
    關(guān)鍵詞:蒺藜響應(yīng)值液料

    張 劍,譚健聰,楊鈺蓉,張 博,韓 祿,劉春葉

    (西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

    蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果實,在中國有著悠久的用藥歷史,歷代醫(yī)學(xué)家對其多有論述和應(yīng)用,目前為臨床常用藥,并被收載入中國藥典?,F(xiàn)代研究表明,蒺藜在心腦血管、抗氧化、抗衰老、改善性功能、治療皮膚病等方面具有重要作用[1-2]。蒺藜水溶性成分主要是黃酮、皂苷類,黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性[3-5],蒺藜皂苷可以減少自由基的生成,促進(jìn)自由基的清除,減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6-7]。蒺藜提取物可通過干擾花生四烯酸代謝調(diào)節(jié)血小板黏附、抗血小板凝集和抗氧化功能,對心血管疾病具有預(yù)防作用[8]。李明娟等[9]和Sharawy等[10]研究認(rèn)為,蒺藜提取物能夠顯著抑制動物的糖異生作用,同時顯著降低血清甘油三酯含量。因此,從蒺藜中高效、經(jīng)濟(jì)地提取黃酮和皂苷類成分,使蒺藜更廣泛地得到應(yīng)用顯得尤為重要。

    現(xiàn)有的報道大多以蒺藜果為研究對象[11-13],并且是以蒺藜中單一組分的提取作為研究目標(biāo)[14-17],將黃酮和皂苷同時提取并比較蒺藜果和葉中含量的研究并不多見[5]。作者采用綜合評價較高的微波輔助法[11]對蒺藜中黃酮和皂苷同時提取,對比了蒺藜葉和果實中總黃酮和總皂苷的含量,通過響應(yīng)曲面法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以期得到蒺藜中總黃酮和皂苷的最佳提取條件,為蒺藜的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

    1 實驗部分

    1.1 原料、試劑與儀器

    蒺藜果實和葉:產(chǎn)自陜北,經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室張寒副教授鑒定為蒺藜科植物蒺藜的果實和葉。

    薯蕷皂苷:B21176-20mg,蘆丁:B20771-20mg,上海源葉生物科技有限公司;水為超純水;其余試劑均為分析純,市售。

    電熱恒溫水浴鍋:HH-2,北京科偉永興儀器有限公司;電腦微波超聲波組合萃取儀:XH-300A,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;紫外分光光度計:UV762,上海佑科儀器儀表有限公司;循環(huán)水真空泵:SHZ-DⅢ,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    (1)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[18]。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品14.7 mg,加適量甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,用移液管精密吸取該溶液0、1、2、3、4、5和6 mL分別置于25 mL容量瓶中,加0.04 g/mL NaNO2溶液1 mL,搖勻,放置6 min后加入0.1 g/mL Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻,放置6 min后加入0.1 g/mL NaOH溶液10 mL,最后用水稀釋至刻度,搖勻放置15 min。在200~600 nm掃描標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長,在最大吸收波長處測量吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=17.75x+0.005 5,R2=0.998 6。

    (2)皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[18]。精密稱取薯蕷皂苷9.1 mg,加甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中,得薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取該溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mL于7支具塞試管中,水浴加熱揮去溶劑。在每支試管中精密加入高氯酸5 mL,密塞,于25 ℃水浴30 min。取出后立即放入冰水中冷卻,在300~500 nm掃描標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長,在最大吸收波長處測量其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),薯蕷皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=29.867x+0.038 1,R2=0.999 6。

    1.2.2 蒺藜中總黃酮與總皂苷成分的提取方法及提取率比較

    分別取蒺藜葉和果實飲片,粉碎,過孔徑380 μm篩[14],分別用石油醚回流3 h脫脂,陰干,得供試品粉末,于密封袋中保存?zhèn)溆?。精密稱取供試品粉末1.00 g,加入乙醇靜置20 min后進(jìn)行微波提取,減壓過濾提取液,取濾液減壓蒸餾至干,使用甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中,作待測液供黃酮和皂苷提取率測定,比較蒺藜葉和果實的提取率。

    1.2.3 單因素實驗

    以黃酮和皂苷提取率為考察指標(biāo),在微波功率為300 W的條件下分別考察提取時間、提取溫度、m(提取液)∶m(原料)(以下簡稱液料比)、φ(乙醇)4個因素對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響。

    1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

    在單因素實驗基礎(chǔ)上,確定自變量,分別以黃酮提取率和皂苷提取率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken實驗方法對實驗的提取溫度、提取時間、液料比和φ(乙醇)進(jìn)行四因素三水平實驗設(shè)計。數(shù)據(jù)處理采用Design Expert.V 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 蒺藜葉和果實活性成分提取率比較結(jié)果

    蒺藜葉和果實活性成分提取率見表1。

    表1 葉和果實提取率比較結(jié)果

    由表1可知,蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率,故選擇蒺藜葉作為蒺藜活性成分提取工藝優(yōu)化的原料,擴(kuò)大中藥來源,可為藥材的選擇提供借鑒和參考。

    2.2 單因素實驗結(jié)果

    2.2.1 提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

    精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g,固定提取溫度為30 ℃,功率為300 W,液料比為30,φ(乙醇)=70%,靜置20 min后提取,設(shè)定提取時間分別為5、10、15、20、25、30和35 min,考察提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響,結(jié)果見圖1。

    t/min圖1 微波時間對黃酮及皂苷提取率的影響

    由圖1可知,在提取過程中,隨著時間的增加,黃酮和皂苷提取率逐漸增加,這是因為溶劑隨時間增長逐漸滲透到細(xì)胞內(nèi)部,直至皂苷和黃酮達(dá)到溶解平衡。在提取時間為25 min黃酮和皂苷的提取率達(dá)到最大值。時間繼續(xù)延長,提取率有所下降,這可能是由于時間過長導(dǎo)致過多雜質(zhì)也隨之析出,且目標(biāo)產(chǎn)物也容易分解,從而影響黃酮和皂苷的收率[18]。

    2.2.2 提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

    精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g,固定提取時間為25 min,功率為300 W,液料比為30,φ(乙醇)=70%,靜置20 min后提取,設(shè)定提取溫度分別為30、40,50、60和70 ℃,考察提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響,結(jié)果見圖2。

    t/℃圖2 溫度對黃酮和皂苷提取率的影響

    由圖2可知,隨著溫度的升高,黃酮提取率逐漸升高,在60 ℃時提取率趨于穩(wěn)定;皂苷提取率先上升,60 ℃后有下降的趨勢。由此說明,提取溫度也不是越高越好,因為提取溫度過高可能導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的分解,提取率反而下降[19]。

    2.2.3 液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

    精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g,固定提取時間為25 min,提取溫度為60 ℃,功率為300 W,φ(乙醇)=70%,設(shè)定液料比10~70,靜置20 min后提取,考察液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響,結(jié)果見圖3。

    液料比圖3 液料比對黃酮和皂苷提取率的影響

    由圖3可知,液料比對黃酮和皂苷提取率影響較大,隨著液料比逐漸增大,黃酮和皂苷提取率有較大的提升,在液料比為50時趨于穩(wěn)定,若進(jìn)一步擴(kuò)大液料比不僅對黃酮和皂苷提取率貢獻(xiàn)意義不大,反而增加了提取成本。

    2.2.4φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

    精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g,固定提取時間為25 min,功率為300 W,液料比為50,提取溫度為60 ℃,靜置20 min后提取,設(shè)定φ(乙醇)=10%、30%、50%、70%和90%,考察φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響,結(jié)果見圖4。

    φ(乙醇)/%圖4 φ(乙醇)對黃酮和皂苷提取率的影響

    由圖4可知,隨著φ(乙醇)的升高,黃酮和皂苷提取率變化顯著,呈先升后降的趨勢,當(dāng)φ(乙醇)=70%,黃酮和皂苷提取率同時達(dá)到最大值。

    2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

    根據(jù)蒺藜黃酮和皂苷單因素提取結(jié)果,得蒺藜黃酮和皂苷提取率(Y1和Y2)為評價指標(biāo),對微波提取時間(A)、微波提取溫度(B)、液料比(C)、φ(乙醇)(D)為主要影響因素,每個因素3個水平,Box-Behnken實驗設(shè)計的因素水平表見表2,響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

    表2 蒺藜黃酮和皂苷提取實驗因素水平及編碼

    表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

    續(xù)表

    2.3.1 方差分析

    分別對以黃酮和皂苷提取率為響應(yīng)值建立的回歸模型進(jìn)行方差分析,考察回歸模型的顯著性、重現(xiàn)性、擬合程度以及各因素對響應(yīng)值的影響情況。

    (1)以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

    表4 以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析1)

    由表4可知,該模型P<0.000 1,表明模型達(dá)到高度顯著水平。失擬項P=0.067 3>0.05,表現(xiàn)為不顯著;校正確定系數(shù)R2=0.902 0,說明該模型能解釋90.20%的響應(yīng)值變化,擬合程度良好,能夠較好地反映微波提取時間,微波提取溫度,液料比和φ(乙醇)與蒺藜黃酮提取率的關(guān)系;模型響應(yīng)值的變異系數(shù)CV=5.90%,表明實驗操作重復(fù)性好(<10%)。因此可以用此模型對蒺藜黃酮提取進(jìn)行分析和預(yù)測,各因素對蒺藜黃酮提取率影響的大小順序為溫度>液料比>時間>φ(乙醇)。各因素對蒺藜黃酮提取率的交互影響不顯著。

    (2)以皂苷提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析見表5。

    表5 以皂苷提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析1)

    由表5可見,該模型P=0.002 1,達(dá)到極顯著水平;失擬項P=0.004,表現(xiàn)為極顯著,說明實驗中存在誤差較大的失擬因素;校正確定系數(shù)R2=0.837 4,說明該模型能解釋83.74%的響應(yīng)值變化;變異系數(shù)CV=2.66%,說明該實驗重復(fù)性良好(<10%);4個因素中,溫度、φ(乙醇)對響應(yīng)值影響極顯著,按影響大小排序為溫度>φ(乙醇)>液料比>時間;X1X2、X2X3、X3X4、X1X3、X1X4、X2X4的P值均大于0.1,說明各因素對響應(yīng)值的交互影響不顯著。

    2.3.2 各因素交互作用分析

    (1)以黃酮提取率為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面分析。根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間對蒺藜中黃酮提取率的交互影響3D響應(yīng)面圖,見圖5~圖8。

    圖5 溫度和時間交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖6 時間和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖7 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖8 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    響應(yīng)面圖中越陡峭的一方,其對提取的影響越大。由圖5可知,溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響;由圖6可知,液料比的影響略大于提取時間的影響;由圖7可知,φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響;由圖8可知,溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得,溫度對蒺藜中黃酮的提取率影響最大,其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間,與方差分析得出的結(jié)論一致。

    (2)以皂苷提取率為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面分析。根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間對蒺藜中皂苷提取率的交互影響3D響應(yīng)面圖見圖9~圖12。

    圖9 溫度和時間交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖10 時間和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖11 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

    圖12 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的等高線圖和3D響應(yīng)面圖

    響應(yīng)面圖中越陡峭的一方,其對提取的影響越大。由圖9可知,溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響;由圖10可知,液料比的影響略大于提取時間的影響;由圖11可知,φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響;由圖12可知,溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得,溫度對蒺藜中皂苷的提取率影響最大,其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間,與方差分析得出的結(jié)論一致。

    2.3.3 最佳條件預(yù)測與驗證

    通過Design Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析,得到最佳提取工藝為時間20.32 min,溫度70 ℃,液料比70,φ(乙醇)=69.88%。在此條件下,黃酮和皂苷提取率分別為0.71%、2.02%。平行進(jìn)行3組實驗對最佳工藝進(jìn)行驗證,為了便于操作,選取提取時間為20 min,φ(乙醇)=70%,溫度為70 ℃,液料比為70。結(jié)果表明,總黃酮的提取率分別為0.69%、0.71%、0.68%,平均值為0.69%;總皂苷提取率分別為1.99%、2.11%、1.98%,平均值為2.03%,與預(yù)測值基本吻合,說明預(yù)測模型可靠。

    3 結(jié) 論

    蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率;響應(yīng)曲面法不但可以對微波輔助提取蒺藜中黃酮和皂苷工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,還可以對最佳提取條件下的提取率進(jìn)行預(yù)測,預(yù)測值與實際測量值吻合度較高。研究的最佳提取產(chǎn)率高于相關(guān)文獻(xiàn)報道[14,18],由此表明,該方法能兼顧2種活性成分提取率的最大化,避免生產(chǎn)中的資源浪費(fèi),對資源的合理開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義,也可為相關(guān)研究和工業(yè)化生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化提供借鑒和參考。

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