兒童腦瘧疾外周血的基因表達譜改變及生物信息學分析

貴州醫(yī)科大學寄生蟲學教研室 貴州 貴陽 550004

瘧疾是一種全球性蟲媒傳染病，因按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的。目前盡管在控制瘧疾方面取得了持續(xù)的成功，但每年仍有2億多新感染，近50萬人死亡，其中大多數(shù)是5歲以下的嬰兒和兒童[1-2]。最嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥為鬧瘧疾，四分之一的患兒在暴露后至少持續(xù)2年會出現(xiàn)神經(jīng)認知障礙，包括行為問題，心理健康問題和癲癇的發(fā)展。這使得腦瘧疾成為該地區(qū)兒童神經(jīng)殘疾的主要原因。因此，利用生物信息學方法篩選腦瘧疾的分子靶標并探討起生物學功能，對于該病的診斷治療及預防具有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GEO(Gene Expression Omnibus)中下載數(shù)據(jù)集GSE1124，該數(shù)據(jù)采用Affymetrix Human Genome U133B Array基因表達芯片平臺的GPL97檢測獲得。數(shù)據(jù)集中包括5例正常對照組兒童及4例患有腦瘧疾的兒童。

1.2 差異基因的篩選 數(shù)據(jù)標準化后，通過R軟件的limma包(version"3.6")進行差異基因的分析，基因表達之間的q值通過T檢驗確定，并使用Benjamin Hochberg(BH)方法進行調(diào)整。以q值＜0.05和|log 2fold change(FC)|＞1為截斷標準的基因為差異基因(Differentially expressed genes，DEGs)。

1.3 功能和KEGG富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對DEGs進行GO注釋和KEGG通路分析，DAVID是一個重要的在線分析工具，可以為大規(guī)模基因或蛋白列表提供系統(tǒng)、全面的生物功能注釋信息[4]。主要用于DGEs基因功能及途徑的富集分析。最后，利用R.的ggplot2對富集分析進行可視化。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡分析 為了評估941個DEGs之間的交互關(guān)系，我們將DGEs的基因符號輸入到STRING(https://string-db.org/)(version11.0)中，相互作用得分是＞0.7為顯著。然后利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，利用插件分子復合物檢測Cyto Hubba對網(wǎng)絡模塊進行篩選，以前10作為核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 該數(shù)據(jù)集共獲得差異基因941個，其中上調(diào)基因為446個，下調(diào)基因為495個(圖1)。

圖1 GSE1124差異基因火山圖

2.2 差異基因的功能富集分析 為了進一步了解差異基因的生物學功能，我們進行的富集分析。其結(jié)果為，GO(Gene Onotology)中BP主要富集在T細胞分化，Notch信號通路的調(diào)控，前腦神經(jīng)元的生成等，CC主要富集在核被膜，呼吸鏈復合物IV等，MF主要富集在鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性等。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)主要富集在JAK-STAT signaling pathway和鈣離子信號通路等。

2.3 PPI網(wǎng)絡分析及核心基因的篩選 根據(jù)PPI網(wǎng)絡分析，并用Cytoscape進行可視化。利用cytoHubba進行分析，根據(jù)degree前10進行篩選基因，得到 RPS7，RPS24，RPS29，EGFR，RPL34，RPL22L1，RPL7，EIF3B，ELAVL1，SOCS3。Metscape分析后發(fā)現(xiàn)這10個差異基因主要富集于分解代謝過程的負調(diào)控及細胞質(zhì)的翻譯等(圖2)。

圖2 差異基因網(wǎng)路互作關(guān)系圖

3 討論

重癥瘧疾是一種由宿主和寄生蟲因素共同驅(qū)動的多系統(tǒng)疾病，在臨床上可表現(xiàn)為1個或多個以下綜合征:腦型瘧疾，黑水熱，嚴重貧血，急性呼吸窘迫綜合征，高寄生蟲血癥，代謝并發(fā)癥[3]。在在重型瘧疾中，腦型瘧疾是由寄生蟲依附于腦血管引起，癥狀可能包括精神狀態(tài)改變，昏迷，癲癇發(fā)作和顱內(nèi)壓升高等。撒哈拉以南非洲地區(qū)的兒童每年受害超過57.5萬例，受影響最大。幸存的患者神經(jīng)和認知缺陷，行為困難和癲癇的風險增加，這使得腦瘧疾成為該地區(qū)兒童神經(jīng)殘疾的主要原因。因此，篩選出腦瘧疾的分子靶標對于該病的預防和治療具有一定的指導性意義。

本研究從NCBI網(wǎng)站的GEO中篩選出兒童瘧疾的全血轉(zhuǎn)錄組，并進行生物信息學的分析。結(jié)果顯示，對照組和鬧瘧疾組中共有941個差異表達基因，其主要富集于T細胞分化，Notch信號通路的調(diào)控，前腦神經(jīng)元的生成，呼吸鏈復合物IV，JAK-STAT signaling pathway和鈣離子信號通路等。在PPI網(wǎng)絡構(gòu)建中，我們也發(fā)現(xiàn)根據(jù)degree進行分析得到10個核心基因，其中RPS7，RPS24，EGFR，RPL34，RPL22L1，SOCS3為 上 調(diào) 基 因，RPS29，RPL7，EIF3B，ELAVL 1為下調(diào)基因。提示，在兒童重癥瘧疾的鬧瘧疾中其疾病的發(fā)生發(fā)展收到基因組的調(diào)控。在更進一步的富集分析后，我們發(fā)現(xiàn)，這10個核心基因主要富集在病毒基因的表達，ER靶向蛋白等有關(guān)。

RPS7，RPS24，RPL34，RPS29，RPL7，RPL22L1均是核糖體蛋白，是催化蛋白質(zhì)合成的細胞器，主要研究在腫瘤鄰域[5-6]。細胞因子信號傳導抑制因子3(SOCS3)是眾所周知的Janus激酶信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK/STAT 3)信號通路的反饋抑制劑，其介導許多細胞因子，生長因子和激素的信號轉(zhuǎn)導，在調(diào)節(jié)感染和炎癥性疾病結(jié)局中具有重要的作用。EGFR(表皮生長因子受體)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。該基因編碼的蛋白是跨膜糖蛋白，它是蛋白激酶超家族的成員。該蛋白是表皮生長因子家族成員的受體。EGFR是一種細胞表面蛋白，可與表皮生長因子結(jié)合，從而誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，從而導致細胞增殖。它被很多的癌癥證實為疾病的驅(qū)動因素而被認為是分子靶標[8-10]。

目前，對于兒童重癥瘧疾的死亡率有所降低，但是其發(fā)病機制仍舊不清楚。在我們目前的研究中，我們使用了生物信息學方法篩選了兒童腦瘧疾的DEGs，之后篩選出了核心基因并分析其生物學，這個為兒童重癥瘧疾的發(fā)病機制提供了新的見解。