狄斯瓦螨對(duì)意大利蜜蜂工蜂呼吸代謝的影響

譚 靜, 武江利, 涂洋洋, Tessema AYNALEM,2, 于慧敏,李南南, 李小英, 徐書法，*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093;2. College of Agriculture and Environmental Science, Bahir Dar University, P. O. Box 5501, Bahir Dar, Ethiopia)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡(jiǎn)稱“意蜂”)是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，不僅為人類提供多種綠色健康的蜂產(chǎn)品，而且作為重要的授粉昆蟲，每年為全球價(jià)值2 150億美元的農(nóng)作物進(jìn)行授粉(Brittain and Potts, 2010; Gilletal., 2012; Smithetal., 2013)。近年來(lái)，全球出現(xiàn)的蜂群損失現(xiàn)象使養(yǎng)蜂業(yè)和依賴蜜蜂授粉的種植業(yè)受到嚴(yán)重威脅(Piouetal., 2019)。狄斯瓦螨Varroadestructor隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)蜱螨亞綱(Acari)寄螨總目(Parasitiformes)瓦螨科(Varroidae)(Anderson and Trueman, 2000)，是威脅蜜蜂健康最為嚴(yán)重的致病因子，不僅可通過(guò)寄生在蜜蜂身體上消耗脂肪體來(lái)?yè)p害蜜蜂健康(Ramseyetal., 2019)，還可通過(guò)攜播病毒的方式，影響蜜蜂新陳代謝、抑制免疫及縮短壽命(Annosciaetal., 2012; Nazzietal., 2012)。

呼吸代謝是一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，通過(guò)研究昆蟲呼吸代謝的變化規(guī)律，對(duì)于分析其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性、了解代謝底物的利用情況以及評(píng)價(jià)昆蟲機(jī)體的生理狀態(tài)具有重要意義(Slamaetal., 2007; DeVries and Appel, 2013; 王冬梅等, 2014; DeVriesetal., 2015)。蜜蜂作為一種完全變態(tài)的社會(huì)性昆蟲，在不同的條件下，其呼吸代謝存在不同的變化特征。Allen(1959)研究發(fā)現(xiàn)，出房18 h后的工蜂隨日齡增加呼吸代謝不斷升高，在2日齡時(shí)工蜂呼吸率最低；Jungmann等(1989)采用瓦氏微量呼吸儀和氣體分析儀分析發(fā)現(xiàn)，蜜蜂在靜止?fàn)顟B(tài)下的呼吸率顯著高于飛行狀態(tài)；夏邦穎和郭郛(1965)利用瓦氏微量呼吸儀分析發(fā)現(xiàn)，生殖型個(gè)體(蜂王和雄蜂)的呼吸代謝高于非生殖型個(gè)體(工蜂)；繆曉青等(2001)利用DKW-3型微量呼吸檢壓儀研究發(fā)現(xiàn)，意蜂工蜂蛹期呼吸商(respiratory quotient, RQ)明顯高于中華蜜蜂Apisceranacerana；盧宜娟等(2008)利用華勃式微量呼吸檢壓儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂和意大利蜜蜂受精卵在不同發(fā)育時(shí)間其耗氧量存在明顯差異，可能與受精卵內(nèi)在發(fā)育機(jī)制的調(diào)控相關(guān)。目前，影響蜜蜂呼吸代謝的因素的研究多集中在溫度、種類、日齡、行為等方面，而關(guān)于在寄生蟲等生物危害因子對(duì)蜜蜂呼吸代謝的影響方面研究較少，尤其是狄斯瓦螨這一重要的全球性蜜蜂寄生蟲對(duì)宿主呼吸代謝的影響未見報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定狄斯瓦螨侵染不同發(fā)育時(shí)期意蜂的耗氧量、CO2釋放量和呼吸商，分析染螨后意蜂成蜂呼吸相關(guān)基因的表達(dá)量變化規(guī)律，以期明確在狄斯瓦螨侵染下意蜂呼吸代謝的變化規(guī)律，為今后深入研究狄斯瓦螨與意蜂之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 意蜂蟲源及處理

實(shí)驗(yàn)材料于2019年8月取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所蜂場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)分為染螨組和對(duì)照組，每組分為3個(gè)重復(fù)。染螨組：選取3群群勢(shì)大小一致(同種同日齡蜂王，健康蜂群)的蜂群，通過(guò)限王產(chǎn)卵的方法，在蜂王產(chǎn)卵后將其移出。實(shí)驗(yàn)中，為獲得準(zhǔn)確日齡的實(shí)驗(yàn)用蜂，我們對(duì)相同日齡的幼蟲、蛹在巢框上標(biāo)記，對(duì)新出房成蜂進(jìn)行蜂體標(biāo)記。狄斯瓦螨取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所染螨實(shí)驗(yàn)蜂群，參考Dietemann等(2013)的方法，于幼蟲封蓋前1 d接螨(每蜂群1頭)，放入健康蜂群中進(jìn)行標(biāo)記、觀察。對(duì)意蜂工蜂4日齡幼蟲、5日齡蛹、新出房成蜂、出房后第6日成蜂分別采樣，其中染螨組以觀察到意蜂體有螨寄生時(shí)取樣。對(duì)照組：選取3群群勢(shì)大小一致的不接螨健康蜂群作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)方法及標(biāo)記方法與染螨組相同。

1.2 意蜂呼吸代謝指標(biāo)的測(cè)定

選取4個(gè)發(fā)育時(shí)期(4日齡幼蟲、5日齡蛹、新出房成蜂和出房后6日齡成蜂)意蜂工蜂放入SSI多通道昆蟲呼吸儀(Sable System International Inc.)的呼吸室內(nèi)(圖1)，恒溫水箱溫度控制在34.5±0.05℃。呼吸室的連接處均涂有油性物質(zhì)，以保證呼吸室的密閉性，用CaSO4干燥劑除去從空氣中進(jìn)入到多通道昆蟲中呼吸儀的水。調(diào)整進(jìn)氣流速為90 mL/min，待整個(gè)測(cè)量裝置穩(wěn)定后，將待測(cè)意蜂放入呼吸室測(cè)量，每頭蜜蜂測(cè)試時(shí)間為3 min，數(shù)據(jù)通過(guò)ExpeData程序軟件進(jìn)行儲(chǔ)存和分析。樣本均實(shí)行單頭測(cè)試，第一通道為空白管，用于校準(zhǔn)基線。每個(gè)時(shí)期重復(fù)5次，每次測(cè)量7頭蜜蜂。

圖1 SSI多通道蜜蜂呼吸測(cè)定示意圖

1.3 呼吸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定

用Trizol(Invitrogen產(chǎn)品)分別提取6日齡染螨成年工蜂和健康成年工蜂的RNA，隨后按照第1鏈合成試劑盒HiFiScirpt cDNA(康為世紀(jì))的操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，分別設(shè)計(jì)5個(gè)呼吸相關(guān)基因的RT-qPCR引物(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)SYBR FAST qPCR Kit(KAPA Biosystems, KK4601)的說(shuō)明配制反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件： 95℃ 5 min; 95℃ 3 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)；熔解程序： 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s, 每0.6℃進(jìn)行 1 次熒光監(jiān)測(cè)。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR所用引物信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用單因素方差(ANOVA)分析不同時(shí)期染螨意蜂和健康意蜂耗氧量(mL/min)、CO2釋放量(mL/min)和呼吸商變化，Duncan氏多重比較分析差異顯著性(P<0.05)。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析染螨成蜂與健康成蜂耗氧量、CO2釋放量和呼吸商以及呼吸相關(guān)基因表達(dá)量的差異顯著性(P<0.05)。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 染螨意蜂與健康意蜂工蜂耗氧量的比較分析

染螨意蜂與健康意蜂工蜂個(gè)體平均耗氧量如圖2所示。結(jié)果表明，在4日齡時(shí)，染螨意蜂與健康意蜂幼蟲期耗氧量一致，均為0.0095 mL/min。健康意蜂耗氧量從4日齡幼蟲至出房后6日齡成蜂呈逐漸上升趨勢(shì)，至6日齡成蜂時(shí)耗氧量達(dá)最大，為0.0344 mL/min，顯著高于其他時(shí)期的耗氧量(P<0.05)。與健康意蜂不同，染螨意蜂工蜂耗氧量變化曲線為先升后降，其中5日齡蛹期耗氧量最高，達(dá)0.0244 mL/min，顯著高于4日齡幼蟲、新出房成蜂和出房后6日齡成蜂的耗氧量(P<0.05)；隨后染螨新出房意蜂耗氧量迅速降低，至6日齡成蜂時(shí)耗氧量最低，為0.0093 mL/min，極顯著低于健康意蜂同日齡成蜂耗氧量(P<0.01)。

圖2 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發(fā)育時(shí)期意蜂工蜂耗氧量的差異

2.2 染螨意蜂與健康意蜂工蜂CO2釋放量的比較分析

由圖3可知，健康意蜂CO2釋放量從4日齡幼蟲至6日齡成蜂呈逐漸上升趨勢(shì)，至6日齡成蜂時(shí)CO2釋放量達(dá)最大，為0.0316 mL/min，顯著高于其他時(shí)期CO2釋放量(P<0.05)。與健康意蜂不同，染螨意蜂CO2釋放量變化特征為先升后降，5日齡蛹期CO2釋放量最高，達(dá)0.0174 mL/min，顯著高于4日齡幼蟲、新出房成蜂和6日齡成蜂時(shí)期的CO2釋放量(P<0.05)；染螨意蜂的CO2釋放量以5日齡蛹期為拐點(diǎn)，5日齡蛹期至新出房成蜂的CO2釋放量迅速降低，低至0.0053 mL/min，極顯著低于同齡期健康意蜂CO2釋放量(P<0.01)；新出房成蜂與6日齡成蜂期比較，染螨意蜂CO2釋放量變化曲線下降較小，差異不顯著(P>0.05)。 與健康意蜂相比，染螨意蜂6日齡成蜂CO2釋放量極顯著降低(P<0.01)。

圖3 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發(fā)育時(shí)期意蜂工蜂CO2釋放量的差異

2.3 染螨意蜂與健康意蜂工蜂呼吸商的比較分析

呼吸商(RQ)是CO2的釋放量和O2消耗量的比值，常用來(lái)判斷呼吸底物性質(zhì)的指標(biāo)。由表2可知，隨著意蜂的發(fā)育，健康意蜂呼吸商沒(méi)有明顯變化，總體呈平緩上升趨勢(shì)，雖然6日齡成蜂時(shí)呼吸商達(dá)最高，為0.9169，但與其他發(fā)育階段的呼吸商相比，差異不顯著(P>0.05)。與健康意蜂相比，染螨意蜂呼吸商呈下降變化趨勢(shì)，尤其是成蜂時(shí)期，呼吸商低于0.6，顯著低于健康意蜂(P<0.05)。

表2 狄斯瓦螨感染的與健康的不同發(fā)育時(shí)期意蜂工蜂的呼吸商

圖4 狄斯瓦螨感染的與健康意蜂成年工蜂呼吸代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 狄斯瓦螨感染后意蜂成年工蜂呼吸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

染螨成年工蜂與健康成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的相對(duì)表達(dá)量見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染螨成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的表達(dá)量均高于健康成年工蜂，且CytB和CytC的相對(duì)表達(dá)量分別是健康成年工蜂的1.7676和1.9929倍，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

3 討論

昆蟲耗氧量、CO2釋放量的測(cè)定是研究其呼吸代謝功能的一種重要指標(biāo)。狄斯瓦螨作為全世界意蜂蜂群最具毀滅性的害蟲之一，嚴(yán)重影響著意蜂生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝強(qiáng)度(秦瑤等, 2018)。研究表明，昆蟲在適宜環(huán)境內(nèi)呼吸代謝平穩(wěn)，處于最協(xié)調(diào)狀態(tài)；當(dāng)受到外界壓力刺激時(shí)，呼吸代謝則出現(xiàn)大幅度變化，昆蟲可通過(guò)一系列生理活動(dòng)(早熟化蛹)、生化反應(yīng)(呼吸商變化、ATP變化等)或相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)外界壓力(Addo-Bediakoetal., 2002; Martinezetal., 2017)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，意蜂受狄斯瓦螨侵染后，其耗氧量、CO2釋放量呈先升后降趨勢(shì)，其中耗氧量從5日齡蛹期的0.0244 mL/min下降至6日齡成蜂期的0.0093 mL/min，CO2釋放量從5日齡蛹期的0.0174 mL/min下降至6日齡成蜂期的0.0040 mL/min，在整個(gè)變化中可明顯看到一個(gè)拐點(diǎn)期，即意蜂5日齡蛹期的耗氧量和CO2釋放量達(dá)到最高，顯著高于健康意蜂(圖2和3)。這可能與狄斯瓦螨入侵宿主蛹期后導(dǎo)致其機(jī)體出現(xiàn)增強(qiáng)呼吸代謝的自我調(diào)節(jié)有關(guān)，由于狄斯瓦螨通常寄生于意蜂蛹發(fā)育時(shí)期，該時(shí)期最大的特點(diǎn)是面對(duì)外界生物侵襲時(shí)防御能力較低，此時(shí)期的蛹不需要攝取外界食物，因此蛹期的耗氧量和CO2釋放量達(dá)到最高，隨后隨著狄斯瓦螨侵染，意蜂呼吸代謝大幅下降。盡管不同外界因素對(duì)蜜蜂呼吸代謝影響的研究較多(Jungmannetal., 1989; 繆曉青等, 2001; 盧宜娟等, 2010)，但未見涉及有害生物因子如寄生蟲等對(duì)蜜蜂呼吸代謝影響的報(bào)道，本研究首次分析了受狄斯瓦螨侵染后意蜂呼吸代謝的變化規(guī)律，對(duì)今后指導(dǎo)蜂螨防治具有重要意義。

呼吸商作為判斷昆蟲代謝底物類型的重要指標(biāo)，可直觀反映昆蟲在不同發(fā)育時(shí)期、不同環(huán)境狀態(tài)下所消耗的代謝底物種類。本研究發(fā)現(xiàn)，健康意蜂4日齡幼蟲呼吸商為0.8540，5日齡蛹呼吸商為0.7837，6日齡成蜂呼吸商為0.9169(表2)。前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲的呼吸商可反映出代謝底物類型，呼吸商在0.71時(shí)，呼吸代謝底物為脂類，呼吸商在0.8時(shí)，呼吸代謝底物為蛋白質(zhì)，呼吸商在1.0時(shí)，呼吸代謝底物為碳水化合物(吳坤君等, 1989)，根據(jù)前人的研究結(jié)果，可以推測(cè)正常發(fā)育意蜂幼蟲期呼吸代謝底物主要為蛋白質(zhì)，蛹期主要為脂類，成蜂期主要為碳水化合物。這種推論與意蜂生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)的食物供給相一致。而受狄斯瓦螨侵染后，意蜂呼吸商劇烈下降，從5日齡蛹期的呼吸商0.7049下降至6日齡成蜂期的0.4424，顯著低于健康意蜂(表2)，這可能與意蜂受到外界脅迫后，可通過(guò)調(diào)節(jié)呼吸代謝水平的強(qiáng)弱、調(diào)整代謝底物的類型等方式來(lái)提高其對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力有關(guān)。但隨著狄斯瓦螨侵染，一方面可促使DWV等病毒顯著增殖，導(dǎo)致意蜂體液免疫和細(xì)胞免疫等代謝水平發(fā)生紊亂，另一方面意蜂代謝底物的大量消耗及有毒代謝物的積累，可嚴(yán)重破壞意蜂正常代謝途徑，從而影響意蜂正常的生理生化代謝，這與Hatjina等(2013)、DeVries等(2015)、錢雪等(2016)、何立志等(2017)和閆蒙云等(2018)的研究結(jié)果相近，認(rèn)為當(dāng)受溫度、饑餓、殺蟲劑等因素脅迫下，昆蟲可通過(guò)改變代謝底物的類型來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)不良因子的抵抗力。

研究表明，同一物種不同品種、相同品種不同狀態(tài)下的昆蟲其呼吸商也存在較大差異。Jungmann等(1989)研究表明，低溫下(Ta=10℃)休息的成蜂呼吸商為1.01，與高溫下(12.5℃≤Ta≤35℃)活動(dòng)的成蜂呼吸商差異不顯著，長(zhǎng)時(shí)間飛行的蜜蜂呼吸商顯著小于1.00?？姇郧嗟?2001)研究發(fā)現(xiàn)，中蜂工蜂蛹期呼吸商為0.798，意蜂工蜂蛹期呼吸商為0.846。盧宜娟等(2010)研究表明，中華蜜蜂幼蟲期呼吸商為0.838，意大利蜜蜂幼蟲期為0.870，中華蜜蜂蛹期呼吸商為0.760，意大利蜜蜂蛹期為0.770。與繆曉青(2001)和盧宜娟(2010)的研究比較發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂幼蟲期和蛹期的呼吸商均低于意蜂，動(dòng)態(tài)范圍在0.7～0.9之間，染螨意蜂呼吸商均明顯低于健康意蜂呼吸商，染螨后呼吸商急劇下降低于0.5。因此，蜜蜂呼吸商低于0.5時(shí)，可作為科學(xué)評(píng)價(jià)其受外界危害程度的一個(gè)閾值。本實(shí)驗(yàn)對(duì)染螨條件下參與意蜂呼吸代謝的5個(gè)侯選基因(Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt)的表達(dá)特性進(jìn)行了初步研究。其中Coq7(也稱為mclk-1)是一種羥化酶(coq7p)，參與輔酶(CoQ)合成途徑的最后一步(Acostaetal., 2016)；核編碼線粒體翻譯起始因子2(IF-2mt)，是線粒體蛋白質(zhì)合成的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶；線粒體編碼的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COXⅠ)，是細(xì)胞色素C氧化酶(復(fù)合物Ⅳ)的催化亞單位之一，呼吸鏈的末端酶，可將電子從CytC上轉(zhuǎn)移到O2(Coronaetal., 2005)。細(xì)胞色素C存在于線粒體內(nèi)膜上，作為呼吸鏈的重要一員，影響ATP的產(chǎn)生。細(xì)胞色素B(CytB)、細(xì)胞色素C(CytC)為生命體內(nèi)氧化還原鏈上重要的電子傳遞體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)中是起始凋亡途徑的關(guān)鍵一步，被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑的重要標(biāo)志(Liuetal., 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，受狄斯瓦螨侵染后，意蜂成年工蜂中與呼吸相關(guān)侯選基因的表達(dá)量均高于健康成蜂(圖4)，這與前人的報(bào)道(Navarroetal., 2002)相似。意蜂從蛹期至成蜂期呼吸商降低，其與呼吸相關(guān)基因的表達(dá)卻明顯提高，其中CytB和CytC基因在染螨前后表達(dá)差異顯著(圖4)，推測(cè)受狄斯瓦螨侵染后，意蜂機(jī)體呼吸代謝受到較大影響，初期可通過(guò)調(diào)節(jié)呼吸和消耗代謝底物(脂類)進(jìn)行適應(yīng)性防御，但隨著代謝底物的大量消耗，最終導(dǎo)致染螨后意蜂成蜂代謝紊亂、壽命縮短，這與Bowen-Walker和Gunn(2001)和Ramsey等(2019)研究結(jié)果相似。

本研究?jī)H對(duì)染螨條件下意蜂的呼吸代謝進(jìn)行了初步研究，今后應(yīng)進(jìn)一步研究在狄斯瓦螨侵染過(guò)程中，與意蜂呼吸相關(guān)基因所涉及代謝途徑的調(diào)控機(jī)制，以及蜜蜂機(jī)體在適應(yīng)調(diào)節(jié)及應(yīng)激條件下，與呼吸代謝相關(guān)因子表達(dá)規(guī)律及細(xì)胞傳導(dǎo)途徑，對(duì)今后開展蜜蜂與寄生螨之間的互作研究奠定基礎(chǔ)，為有效防控螨害提供依據(jù)。