針葉揮發(fā)物組分對(duì)楚雄腮扁葉蜂引誘活性的分析

馬惠芬 閆爭(zhēng)亮 毛云玲 劉 凌

（云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201）

楚雄腮扁葉蜂（Cehpalica chuxiongnica），隸屬膜翅目（Hymenoptera）扁葉蜂科（Pamphiliidae），是云南松（Pinus yunnanensis）、華山松（Pinus armandii）等松屬樹(shù)種的一大食葉害蟲(chóng)，也危害滇油杉（Keteleeria evelyniana）等其他松科植物[1]。該蟲(chóng)以幼蟲(chóng)取食松樹(shù)葉片，造成樹(shù)木畸形、生長(zhǎng)緩慢，為害嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致寄主死亡；其幼蟲(chóng)取食吐絲形成的灰白色幕巢也影響觀瞻。同時(shí)，楚雄腮扁葉蜂為害，造成樹(shù)勢(shì)衰弱，易引發(fā)小蠹蟲(chóng)等次期性害蟲(chóng)的侵害[2]。自1997年在楚雄市境內(nèi)發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)危害云南松幼林以來(lái)，先已擴(kuò)散到了楚雄、曲靖、文山、紅河和昆明等州市，發(fā)生面積達(dá)近萬(wàn)公頃。危害特點(diǎn)是產(chǎn)卵雌蜂的聚集產(chǎn)卵和低齡幼蟲(chóng)的群集取食，當(dāng)蟲(chóng)口密度較小時(shí)，一般有般2～4頭成蟲(chóng)產(chǎn)卵于同一松梢上，蟲(chóng)口密度較大時(shí)則有多達(dá)18頭雌蜂群集于同一個(gè)松梢上產(chǎn)卵[3]。楚雄腮扁葉蜂幼蟲(chóng)取食松針時(shí)會(huì)很快產(chǎn)生幕巢保護(hù)，而老熟幼蟲(chóng)長(zhǎng)期（每個(gè)世代16個(gè)月左右）在樹(shù)冠下10～30 cm的土層內(nèi)生存[2]?；瘜W(xué)防治施藥時(shí)機(jī)難以把握，防治難度較大。目前，楚雄腮扁葉蜂的有效防治以摘除產(chǎn)卵松針、摘除蟲(chóng)巢、翻挖受害木樹(shù)冠下越冬滯育幼蟲(chóng)等人工防治為主。楚雄腮扁葉蜂種群數(shù)量激劇增加、分布范圍不斷擴(kuò)大、危害程度越來(lái)越重，現(xiàn)有防控措施投入巨大，收效較小。

昆蟲(chóng)化學(xué)信息物質(zhì)已被應(yīng)用到許多農(nóng)林害蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)和防控中[4-8]?；谛畔⒒瘜W(xué)物質(zhì)的監(jiān)測(cè)和誘殺，是方法簡(jiǎn)便、成本較低的楚雄腮扁葉蜂防控策略，具有較好的應(yīng)用前景。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，寄主松樹(shù)的針葉粗提物對(duì)楚雄腮扁葉蜂雄蜂和抱卵雌蜂具有明顯的引誘作用[9]。為了進(jìn)一步研究寄主針葉揮發(fā)物對(duì)楚雄腮扁葉蜂行為的影響，對(duì)云南松針葉的主要揮發(fā)物組分的引誘活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試蟲(chóng)

供試?yán)ハx(chóng)采集自云南省祿豐縣和平村云南松林地內(nèi)，在楚雄腮扁葉蜂即將羽化出土的季節(jié)（5月中旬），踏查松林內(nèi)是否有楚雄腮扁葉蜂為害。選擇樹(shù)冠下散落有前一年度老熟幼蟲(chóng)下樹(shù)入土前遺留的蟲(chóng)巢的松樹(shù)，在樹(shù)干周邊約1 m的地面挖掘深度約20 cm，收集經(jīng)過(guò)越冬即將羽化的的楚雄腮扁葉蜂蛹或者已經(jīng)羽化尚未出土的成蟲(chóng)，帶回室內(nèi)。將淺綠色蛹放入直徑25 cm，高15 cm的透明塑料圓盒內(nèi)，覆蓋濕潤(rùn)的原土待其羽化。采集的成蟲(chóng)則分別雌雄蟲(chóng)（雌蜂前胸背板為銹紅色，而雄蜂則為黑色）則直接放入40 cm×40 cm×40 cm的養(yǎng)蜂籠內(nèi)，喂以10%的蔗糖水，飼養(yǎng)備用；自然室溫20～27 ℃，相對(duì)濕度（60±10）%。

1.1.2 粗提物的制備

采用簡(jiǎn)便的蒸餾萃取法提取樹(shù)葉揮發(fā)油。將新鮮樹(shù)葉剪下后，迅速放入磨口玻璃瓶中密封，將玻璃瓶放入加有醫(yī)用冰袋的保溫瓶中。帶回實(shí)驗(yàn)室后，用醫(yī)用小刀將韌皮部剪碎為2 mm×2 mm的碎屑；稱取100 g放入500 mL的圓底燒瓶中，加入200 mL自來(lái)水和50 mL三氯甲烷；加熱回流2 h后，冷卻至室溫。分離出有機(jī)層后，以玻璃棉過(guò)濾掉不溶物；濾液以無(wú)水硫酸鈉干燥。然后以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀出去溶劑，得到粗提物，于冰箱中4 ℃下保存，備用。

1.1.3 化合物

水蒸氣蒸餾法得到的云南松針葉揮發(fā)物[10]，與利用頂空收集法收集到的針葉揮發(fā)物[11]在組成和比例上差別很大。綜合考慮云南松針葉自然狀態(tài)下?lián)]發(fā)物的釋放情況，選擇了如表1所示的6種化合物，測(cè)試了其對(duì)楚雄腮扁葉蜂的引誘活性。

表1 標(biāo)準(zhǔn)化合物純度及來(lái)源Table 1 Purity and sources of compounds

1.1.4 誘芯和誘捕器

林間試驗(yàn)用誘捕器即為黃色粘蟲(chóng)板（25 cm×30 cm）。

誘芯：以反口小乳膠塞（The west company，Phoenixville，PA）為載體。將松針粗提物以及標(biāo)準(zhǔn)化合物配制成100 μL/mL的正己烷溶液，取溶液50 μL滴在乳膠塞的凹面部分，室溫下待溶劑揮發(fā)后，再滴加50 μL溶液。這樣每個(gè)誘芯載有引誘物質(zhì)10 μL。在密封塑料袋中置于冰箱中保存，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 林間引誘試驗(yàn)

化合物及粗提物的林間誘捕試驗(yàn)在2016年8月3日至8日進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)置在云南省祿豐縣和平村。該村地處東經(jīng)102°12′，北緯25°12′，海拔1 820 m，年平均氣溫16.2 ℃，年降雨量930 mm，寄主植物是云南松和云南油杉。自2012以來(lái)，云南松受害率達(dá)100%，云南油杉受害率達(dá)60%。

將誘芯用細(xì)鐵絲固定在黃色粘蟲(chóng)板上緣中間位置，即為誘捕裝置。將誘捕裝置懸掛于云南松約1.5～2.0 m高度的側(cè)枝上，誘捕裝置之間間距最小10 m。每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)重復(fù)，以未帶誘芯的黃色粘蟲(chóng)板為對(duì)照。7 d后檢查誘捕情況（雌蜂前胸背板為銹紅色，而雄蜂則為黑色），并記錄誘捕量。

1.2.2 室內(nèi)趨向試驗(yàn)

室內(nèi)趨向試驗(yàn)于2016年6月進(jìn)行。試蟲(chóng)采集自云南省祿豐縣和平村進(jìn)行。粗提物和標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度為10 μL/mL。

利用“Y”形嗅覺(jué)儀法，參照張同心等[12]的方法測(cè)試。測(cè)試時(shí)，在一個(gè)球形管內(nèi)放入滴有10 μL溶液紙條（2.0 cm×0.5 cm）作為氣味源（0.1 μL化合物），另一個(gè)球形管內(nèi)放入滴有10 μL的相應(yīng)溶劑的濾紙條作為對(duì)照。試驗(yàn)時(shí)，將試蟲(chóng)放入“Y”型嗅覺(jué)儀主管入口處，用黑色聚乙烯膜覆蓋整個(gè)嗅覺(jué)儀，以免由于趨光性而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。啟動(dòng)真空泵，調(diào)節(jié)“Y”型嗅覺(jué)儀的主管內(nèi)氣流流量為100 L/h。引入試蟲(chóng)2 min后檢查試蟲(chóng)趨向反應(yīng)，如果試蟲(chóng)進(jìn)入作為氣味源的支管或梨形干燥管，記為正趨向；試蟲(chóng)進(jìn)入作為對(duì)照的支管或梨形干燥管，記為負(fù)趨向，如果試蟲(chóng)停留在“Y”型管的主管中則記為無(wú)選擇。用正趨向試蟲(chóng)數(shù)占被測(cè)試的試蟲(chóng)總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示被測(cè)試樣品的活性（趨向率）。每次測(cè)試使用同一批從野外采回的經(jīng)過(guò)飼養(yǎng)的楚雄腮扁葉蜂成蟲(chóng)；每個(gè)氣味源測(cè)試5次，每次測(cè)試時(shí)將10頭雌蜂依次試驗(yàn)；每測(cè)試5頭，調(diào)換1次氣味源。對(duì)經(jīng)過(guò)1輪測(cè)試的試蟲(chóng)不再使用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，以單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)趨向行為

室內(nèi)趨向行為試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～2。楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)針葉粗提物、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯表現(xiàn)出明顯的趨向反應(yīng)，但（+）-α-蒎烯、（+）-檸檬烯則沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的引誘活性（圖1a）。針葉粗提物、（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、β-石竹烯對(duì)雄蜂具有引誘活性（圖1b）。（+）-α-蒎烯對(duì)雌蜂沒(méi)有表現(xiàn)出引誘活性，而對(duì)雄蜂有效；月桂烯則相反，對(duì)雌蜂表現(xiàn)出引誘活性。

圖1 楚雄腮扁葉蜂雌雄蜂對(duì)針葉粗提物及揮發(fā)物主要組分的趨向行為Fig.1 Taxis responses of male and female C.chuxiongnica to crude extracts and main volatile constituents of needle

2.2 林間誘捕結(jié)果

在林間誘捕試驗(yàn)中，與未設(shè)置誘芯的黃色粘蟲(chóng)板相比較，所有被測(cè)試的物質(zhì)都誘捕到了一定量的楚雄腮扁葉蜂（圖2）。但被試物質(zhì)對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌、雄蟲(chóng)的誘捕量有差異。以針葉粗提物、（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯等都誘捕到了比楚雄腮扁葉蜂雌蜂較多的雄蜂，但（+）-檸檬烯對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌雄蜂的誘捕量無(wú)明顯差異（圖3）。

圖2 針葉粗提物及揮發(fā)物主要組分的楚雄腮扁葉蜂的林間平均誘捕量Fig.2 Mean numbers of C.chuxiongnica captured by crude extracts and main volatile constituents of needle

圖3 楚雄腮扁葉蜂雌雄蜂林間平均誘捕量比較Fig.3 Comparison of catch numbers of male and female C.chuxiongnica

3 結(jié)論與討論

室內(nèi)趨向的試驗(yàn)結(jié)果（圖1、圖2）顯示，（-）-（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯都引起楚雄腮扁葉蜂雌蜂明顯的趨向反應(yīng)；（-）-β-蒎烯、β-石竹烯同樣對(duì)雄蜂具有引誘活性。針葉中含量較高的（+）-α-蒎烯[11]沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌蜂明顯的引誘活性，但引起雄蜂的明顯趨向反應(yīng)；月桂烯可引發(fā)雌蜂明顯的趨向反應(yīng)，對(duì)雄蜂無(wú)效。由此可見(jiàn)，寄主針葉的揮發(fā)物對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌蜂、雄蜂都具有一定的引誘作用，但雌雄峰對(duì)針葉揮發(fā)物的組分的嗅覺(jué)反應(yīng)存在一定差異。

從林間誘捕的結(jié)果看（圖3），除（+）-檸檬烯外，（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯誘捕到了明顯多于空白對(duì)照的楚雄腮扁葉蜂，這與室內(nèi)趨向反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，（+）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、月桂烯、β-石竹烯等，誘捕到了較雌蜂為多的雄蜂（圖3）。楚雄腮扁葉蜂也嚴(yán)重危害華山松，華山松針葉粗提物對(duì)楚雄腮扁葉蜂具有明顯的引誘作用[13]。由此看出，楚雄腮扁葉蜂依賴來(lái)自寄主針葉的揮發(fā)物作為其尋找寄主的線索，松樹(shù)針葉揮發(fā)物的各種組成都在楚雄腮扁葉蜂尋找寄主中發(fā)揮作用。

但在室內(nèi)趨向行為測(cè)試中沒(méi)有引起楚雄腮扁葉蜂雄蜂明顯趨向反應(yīng)的月桂烯也誘捕到了明顯多于空白對(duì)照的雄蜂。室內(nèi)試驗(yàn)中，雄蜂沒(méi)有對(duì)月桂烯表現(xiàn)趨向反應(yīng)，但可引起雌蜂的明顯趨向反應(yīng)；林間也表現(xiàn)對(duì)雌蜂的明顯引誘作用，同時(shí)誘捕到大量的雄蜂。這說(shuō)明，可能月桂烯本身并不對(duì)雄蜂產(chǎn)生引誘左右，而是由于誘捕裝置上先前捕獲的雌蜂對(duì)雄蜂產(chǎn)生的引誘作用。

本試驗(yàn)中，針葉粗提物的對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌蜂林間誘捕量并不比單獨(dú)的單萜烯（（-）-β-蒎烯、β-石竹烯）誘捕量大。這可能是由于針葉粗提物中各個(gè)單萜烯的相對(duì)含量[10]與林間自然狀態(tài)下針葉釋放的單萜烯的相對(duì)比例[11]不一致的緣故。針葉粗提物并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌蜂引誘的增效作用。

自然界中大部分昆蟲(chóng)主要依靠嗅覺(jué)來(lái)完成其寄主植物的搜索與識(shí)別過(guò)程，進(jìn)而完成其取食、交配和產(chǎn)卵等行為。其中，寄主植物氣味一般對(duì)昆蟲(chóng)產(chǎn)生引誘或寄主定位的影響[14]。林木害蟲(chóng)同樣依靠寄主揮發(fā)物、非寄主揮發(fā)物來(lái)作出是否降落于寄主樹(shù)上[15]。針葉樹(shù)的單萜烯是小蠹科樹(shù)皮蠹蟲(chóng)尋找適宜寄主的重要的依據(jù)[16-17]；寄主揮發(fā)物在天牛類[18-19]、象甲類[20]昆蟲(chóng)的寄主選擇中也發(fā)揮重要作用。歐洲新松葉蜂雌蜂（Neodiprion sertifer）可辨別意大利五針?biāo)桑≒inus pinea）與歐洲赤松（Pinus sylvestris）和歐洲黑松（Pinus nigra），進(jìn)而避免在意大利五針?biāo)缮袭a(chǎn)卵[21]，歐洲赤松葉鋒（Diprion pini）雌蜂也可辨別歐洲赤松（Pinus sylvestris）、歐洲黑松（Pinus nigra）與北美短葉松（Pinus banksiana）、北美喬松（Pinus strobus）[22]，而將選擇歐洲赤松和歐洲黑松作為其產(chǎn)卵寄主[23]。研究也發(fā)現(xiàn)，楚雄腮扁葉蜂雌蜂選擇云南松、華山松作為其產(chǎn)卵寄主，而避免在滇油杉（Keteleeria evelyniana）上產(chǎn)卵[9]。針葉揮發(fā)物（+）-檸檬烯是決定歐洲新松葉蜂對(duì)意大利五針?biāo)膳c歐洲赤松和歐洲黑松進(jìn)行取舍的重要組分。意大利五針?biāo)舍尫泡^高濃度的（+）-檸檬烯，而歐洲赤松釋放的月桂烯濃度較高；較高濃度的（+）-檸檬烯對(duì)歐洲新松葉蜂具有引誘活性，而濃度較低時(shí)則表現(xiàn)驅(qū)避活性[21]。北美短葉松、北美喬松針葉揮發(fā)物中含有較高濃度的（+）-檸檬烯、β-蒎烯和月桂烯[22]。單萜烯的濃度會(huì)隨離氣味源的遠(yuǎn)近而變化，不能提供寄主樹(shù)的準(zhǔn)確信息；每種松樹(shù)針葉揮發(fā)物中各種單萜烯的比例基本上是不變的，而不同樹(shù)種針葉的單萜類揮發(fā)物比例存在差異，這也許是楚雄腮扁葉蜂尋找適宜寄主的準(zhǔn)確依據(jù)。室內(nèi)趨向測(cè)試只是試驗(yàn)了單萜烯刺激量為0.1 μL情況下試蟲(chóng)的趨向反應(yīng)；這些化合物的引誘活性在其他劑量下是否會(huì)改變，尚待進(jìn)一步研究。