鹽脅迫對(duì)石榴生長(zhǎng)與生理生化特性的影響

董建梅 劉翠玉 趙玉潔 苑兆和

（1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

隨著人口快速增長(zhǎng)，越來(lái)越多的荒地將被開(kāi)墾作為耕地，干旱地區(qū)的灌溉農(nóng)業(yè)，水資源管理不合理，土壤鹽漬化問(wèn)題越來(lái)越突出，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。據(jù)報(bào)道，全球超過(guò)8×109hm2的土地正遭受著鹽脅迫的影響，占全球陸地總面積的6%[2]。中國(guó)鹽堿土占全國(guó)可利用土地面積的4.88%，總面積約為3.6×107hm2，主要分布在東北、華北、西北及沿海地區(qū)[3-4]。鹽堿土是中國(guó)重要的后備土地資源，由于不良的理化性質(zhì)，嚴(yán)重影響了生于其上的作物，可致其減產(chǎn)或死亡，未能被充分利用[5]。改造治理以及合理開(kāi)發(fā)利用鹽漬土壤，對(duì)全球的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)具有重要的意義[6]。開(kāi)展果樹(shù)的耐鹽性研究，篩選出抗鹽品種種植于鹽堿地，既可利用生態(tài)修復(fù)改善土壤鹽漬化問(wèn)題，又可為當(dāng)?shù)氐姆N植戶帶來(lái)經(jīng)濟(jì)收益。

探究鹽脅迫環(huán)境下，植物的生長(zhǎng)和生理生化特性的影響，是選育耐鹽作物的重要基礎(chǔ)。鹽脅迫對(duì)植物生理生長(zhǎng)方面的影響，主要包括膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、光合作用、呼吸作用和代謝生理等方面。鹽脅迫使植物體內(nèi)積累了較多的活性氧（ROS），對(duì)植物體造成不同程度的傷害甚至死亡，滲透調(diào)節(jié)、離子的區(qū)域化、改變光合途徑、清除活性氧、調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素等途徑可應(yīng)對(duì)環(huán)境造成的鹽害脅迫，其中抗氧化酶系統(tǒng)能夠減緩膜脂過(guò)氧化作用的危害[7-10]。目前，植物耐鹽生理研究多以中性鹽NaCl脅迫為主，植物耐鹽閾值的研究越來(lái)越受到關(guān)注。孫曉剛等[11]在不同NaCl脅迫對(duì)‘吉美’海棠（Malus spectabilis）的生長(zhǎng)和生理特性的影響試驗(yàn)中指出，在低濃度（50 mmol/L）脅迫下，‘吉美’的生長(zhǎng)和生理活動(dòng)未受到顯著影響，而在200 mmol/L時(shí)，‘吉美’海棠停止生長(zhǎng)，出現(xiàn)死亡跡象?？追业萚12]指出，200 mmol/L是芍藥（Paeonia lactiflora）耐受NaCl濃度的極限，超過(guò)此濃度，造成不可逆的損傷，甚至死亡，而在低濃度（50～100 mmol/L）下，植株生長(zhǎng)未受到明顯的影響。

石榴（Punica granatum）為千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）[13]，適應(yīng)性強(qiáng)，耐鹽堿較強(qiáng)的落葉果樹(shù)之一[14]，具文化、生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[15]。石榴籽粒象征著團(tuán)結(jié)，多子多福[16]；除了可以直接食用外，石榴還可加工成果汁、果酒、果醬，調(diào)味品，化妝品等，賦予了極大的加工潛力[17]。石榴含有的一些生物活性成分，如有機(jī)酸，多酚，花青素和抗氧化物等，能夠有效地改善心血管健康，防治糖尿病，以及抗癌、抗菌、抗過(guò)敏等[18-20]。消費(fèi)群體不斷增加，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。國(guó)內(nèi)外關(guān)于鹽脅迫的研究多見(jiàn)于作物的生長(zhǎng)、光合和生理特性以及基因方面，在果樹(shù)尤其是石榴抗氧化酶研究中甚是少見(jiàn)[21-22]。本研究旨在探究不同NaCl濃度脅迫下石榴生長(zhǎng)發(fā)育特性，活性氧的產(chǎn)生、抗氧化酶活性，以及抗氧化物質(zhì)含量的影響，以期緩解鹽脅迫產(chǎn)生氧化傷害的可能性，為生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在南京林業(yè)大學(xué)的人工氣候室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。氣候室光照培養(yǎng)，15 h（晝）/9 h（夜），晝/夜溫度為25 ℃/18 ℃，空氣相對(duì)濕度為70%。石榴以‘泰山紅’為研究對(duì)象，該品種具有皮薄，質(zhì)脆，口感好，風(fēng)味佳，耐貯運(yùn)，豐產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

于2017年10月11日，選擇1年生硬枝，修剪成10～15 cm，扦插于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基質(zhì)為V（珍珠巖）∶V（草炭土）=1∶1的混合。于2017年10月10日將鮮果剝籽放入水池搓洗，加入100 mL 98%的濃H2SO4，以剛剛淹沒(méi)種子為宜，用玻璃棒攪10 s左右，當(dāng)發(fā)現(xiàn)開(kāi)始有種子變黑，倒掉濃H2SO4，清水沖洗3～4次后播種于含細(xì)河沙的穴盤(pán)中。20 d的時(shí)候長(zhǎng)出2片子葉，株高5 cm左右時(shí)移栽于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基質(zhì)為V（珍珠巖）∶V（草炭土）=1∶1的混合。實(shí)驗(yàn)材料置于溫室中，每3 d澆1次水，每隔7 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

將生長(zhǎng)6個(gè)月的實(shí)生苗（株高30 cm左右），用不同NaCl濃度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)3盆，5株/盆（根據(jù)苗子的大小，確定合理的生長(zhǎng)空間）。

選擇健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的6個(gè)月生扦插苗（株高30 cm左右），用含不同NaCl濃度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5盆，2株/盆。

每3 d上午10：00澆鹽水1次至飽和，滲出的水回澆，防止鹽分流失，隔6 d用清水沖洗土壤（洗凈殘留的鹽分，以防鹽分積累）。處理12 d后觀察2種植株的生長(zhǎng)情況，分別統(tǒng)計(jì)鹽害率和鹽害指數(shù)，將每棵石榴苗的根、莖、葉洗凈分類收集，放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

采用王業(yè)遴等[23]的鹽害輕重分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，按公式（1）～（2）計(jì)算鹽害率（P）、鹽害指數(shù)（D）；將石榴樣品的根、莖、葉于105 ℃烘箱中殺青15 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量，計(jì)算單株生物量與根冠比。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法[24]測(cè)定；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[25]測(cè)定；過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[26]測(cè)定；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參照張治安等[27]的方法測(cè)定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[28]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[29]測(cè)定；谷胱甘肽（GSH）參照趙旭東等[30]的簡(jiǎn)便測(cè)定法；超氧陰離子（O2·－）采用羥胺氧化法[31]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010預(yù)處理數(shù)據(jù)后，用SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA分析和Duncan多重比較（P＜ 0.05），用Origin 8.5作圖，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)石榴生長(zhǎng)的影響

由表1可知，隨著NaCl濃度增加，實(shí)生苗和扦插苗的鹽害率和鹽害指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），且在NaCl濃度達(dá)200 mmol/L時(shí)，鹽害達(dá)到100%，實(shí)生苗的鹽害指數(shù)較扦插苗的高，最大鹽害指數(shù)為0.47，說(shuō)明實(shí)生苗比扦插苗更易被鹽害。實(shí)生苗的根冠比隨著鹽濃度的增加呈先降后升趨勢(shì)，而扦插苗中的根冠比隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），且扦插苗的根冠比比實(shí)生苗的高，根冠比最大值為0.47。實(shí)生苗的單株生物量隨著鹽濃度的升高而顯著下降（P＜0.05），在濃度為200 mmol/L時(shí)，單株生物量為1.04 g，說(shuō)明高濃度的鹽脅迫抑制了石榴實(shí)生苗的生長(zhǎng)；扦插苗的單株生物量隨著鹽濃度的增加而呈先升后降的趨勢(shì)，且高于實(shí)生苗，單株生物量最高值為100 mmol/L的扦插苗中（4.94 g）。

表1 不同NaCl濃度對(duì)石榴鹽害率、鹽害指數(shù)、根冠比和單株生物量的影響Table 1 Effects of different NaCl concentrations on salt damage rate,salt damage index,root/shoot ratio and the single biomass in P.granatum

2.2 鹽脅迫對(duì)石榴活性氧及MDA含量的影響

由圖1可知，O2·－凈增長(zhǎng)率隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），與空白處理（0 mmol/L）相比，NaCl處理后石榴實(shí)生苗的根、葉的O2·－凈增長(zhǎng)率均較扦插苗高；且在高濃度（200 mmol/L）鹽脅迫環(huán)境下，葉的O2·－凈增長(zhǎng)率比根高，最大值為42.30%。說(shuō)明鹽脅迫環(huán)境下，超氧陰離子自由基積累速率加快，實(shí)生苗中葉的積累量更明顯。

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物之一，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度可通過(guò)其含量來(lái)反映[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，石榴MDA含量隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），實(shí)生苗的根的MDA含量顯著高于葉（P＜0.05），扦插苗與之相反，對(duì)于根而言，實(shí)生苗的MDA含量顯著地高于扦插苗的（P＜0.05）；同一鹽濃度脅迫下，2種苗的葉的MDA含量差別不大，MDA含量最大值位于高鹽濃度（200 mmol/L）實(shí)生苗的根中（32.08 mmol/g）。

圖1 不同NaCl濃度對(duì)石榴O2·－凈增長(zhǎng)速率和MDA含量的影響Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on net growth rate of O2·－ and MDA content in P.granatum

2.3 鹽脅迫對(duì)石榴抗氧化酶活性的影響

由表2可知，隨著鹽濃度的升高，SOD、CAT、POD、APX活性均顯著增加（P＜0.05）。不同的苗木，不同的組織中，抗氧化酶活性的差異顯著（P＜0.05）。NaCl處理后石榴實(shí)生苗葉中的SOD活性比扦插苗葉片中SOD活性高，200 mmol/L時(shí)分別達(dá)到1 542.82、1 269.64 U/(g·min)，不同處理下，扦插苗中根的SOD活性較實(shí)生苗中根的高。鹽脅迫下，石榴實(shí)生苗和扦插苗葉片中的CAT活性均比根部較高，扦插苗根、葉中CAT活性略高于實(shí)生苗的（除200 mmol/L下扦插苗根中862.5 U/(g·min)外），CAT活性最高為扦插苗的葉中（1 283.33 U/(g·min)）。

表2 不同NaCl濃度對(duì)石榴酶活性的影響Table 2 Effects of different NaCl concentrations on enzyme activities in P.granatum U/(g·min)

石榴實(shí)生苗和扦插苗在鹽脅迫環(huán)境下，葉片中的POD活性較根的高，實(shí)生苗根中的POD活性比扦插苗的根中POD活性高，扦插苗葉片中的POD活性比實(shí)生苗的葉片高，POD活性最高在200 mmol/L的鹽濃度下的扦插苗葉片中產(chǎn)生，為438.44 U/(g·min)。石榴扦插苗葉片中的APX活性顯著地高于實(shí)生苗的葉片（P＜0.05），且葉片中的APX活性較根高，說(shuō)明扦插苗的葉片能夠產(chǎn)生大量的APX，APX活性最大值為223.67 U/(g·min)。

2.4 鹽脅迫對(duì)GSH和可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，GSH含量隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），在鹽脅迫環(huán)境中，扦插苗的GSH含量顯著地高于實(shí)生苗的（P＜0.05），其根中GSH含量顯著地高于葉（P＜0.05），最大值為高鹽脅迫下（200 mmol/L）的扦插苗的根中，為773.16 mmol/g。石榴的可溶性蛋白含量均隨NaCl濃度的增加而升高，差異顯著（P＜0.05），葉的可溶性蛋白含量高于根的，實(shí)生苗的根的可溶性蛋白含量顯著地高于扦插苗的根（P＜0.05）；葉與之相反，可溶性蛋白含量最高值為897.23 μg/g，為NaCl濃度200 mmol/L的扦插苗的葉中。

圖2 不同NaCl濃度對(duì)石榴GSH和可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on GSH and soluble protein content in P.granatum

2.5 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表3可知，鹽脅迫下石榴O2·－凈增長(zhǎng)率與MDA和CAT含量呈極限著正相關(guān)（P＜0.01），與POD含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）；MDA與其他指標(biāo)（除O2·－凈增長(zhǎng)率之外）均無(wú)顯著相關(guān)性；GSH含量?jī)H與APX含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.01）；SOD、CAT、POD、APX和Pro含量?jī)蓛芍g均呈極限著正相關(guān)（P＜0.01）。說(shuō)明在鹽害環(huán)境中，O2·－凈增長(zhǎng)率加快，MDA含量增加，各指標(biāo)相互作用來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫逆境。

表3 鹽脅迫下石榴苗木指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis of indexes of P.granatum seedlings and cuttings under salt stress

3 結(jié)論與討論

單株生物量、鹽害率和鹽害指數(shù)反映植物的鹽脅迫的重要形態(tài)特征，也是判斷其耐鹽性大小最直觀的指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，隨著NaCl濃度的升高，鹽害率和鹽害指數(shù)均上升，實(shí)生苗單株生物量下降，在鹽濃度為200 mmol/L時(shí)，鹽害率達(dá)到100%，說(shuō)明鹽脅迫抑制了石榴幼苗的生長(zhǎng)，在Elagamy等[33]試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫也能抑制石榴果實(shí)的生長(zhǎng)，與前人研究鹽脅迫對(duì)鵝耳櫪（Carpinus turczaninowii）[34]、銀水牛果（Shepherdiaargentea）[35]、沙 棘（Hippophae rhamnoides）[36]生長(zhǎng)抑制一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)低鹽濃度對(duì)植物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，如海濱錦葵（Kostelezkya virginica）[37]、弗吉尼亞櫟（Quercus virginiana）[38]、薊（Cirsium japonicum）[39]等，相似的是石榴扦插苗在100 mmol/L時(shí)的NaCl脅迫下生物量略有增加。石榴在鹽脅迫下實(shí)生苗和扦插苗的差異說(shuō)明，實(shí)生幼苗比較幼嫩敏感，更容易受到鹽害損傷。

鹽害環(huán)境下，活性氧積累，引發(fā)或加劇了膜脂的過(guò)氧化作用，膜系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞區(qū)隔化喪失[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn)凈O2·－增長(zhǎng)率隨著土壤鹽濃度的增加而升高，說(shuō)明石榴在鹽脅迫下產(chǎn)生了大量的活性氧，這與付晴晴等[42]對(duì)不同葡萄（Vitis vinifera）株系葉片O2·－產(chǎn)生速率一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度含量的升高，石榴根、葉組織中MDA含量增加，說(shuō)明鹽脅迫加重了膜脂的過(guò)氧化損傷。

活性氧酶促清除劑、抗氧化物質(zhì)能夠平衡活性氧的毒害[43]。Na+過(guò)量積累可誘發(fā)氧化脅迫，進(jìn)而增強(qiáng)SOD活性，使其超表達(dá)，應(yīng)對(duì)逆境，SOD作為抗氧化的第1道防線，可清除超氧化物自由基，并將其轉(zhuǎn)化為H2O2[44-45]。CAT作為清除H2O2的最有效的酶，在處理初期活性最高，而POD和APX在處理后期才起作用[46]。GSH通過(guò)誘導(dǎo)增強(qiáng)植物的滲透調(diào)節(jié)能力和清除活性氧的酶促系統(tǒng)的防御能力，降低受到的氧化脅迫和削弱膜脂過(guò)氧化程度、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，緩解了鹽脅迫的抑制作用[47]。同時(shí)，可溶性蛋白作為一種重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也能夠緩解鹽害[48]。本研究中，隨著鹽濃度的升高，可溶性蛋白含量增加，SOD、CAT、POD、APX活性提高，GSH含量上升，這與劉翠玉等[14]、Liu等[49]其他石榴品種的研究結(jié)果一致，說(shuō)明 ‘泰山紅’同其他石榴一樣，具有一定的耐鹽性[50-51]，且各氧化酶發(fā)揮活性氧清除功能，緩和鹽脅迫危害。另外，研究發(fā)現(xiàn) ‘泰山紅’的不同苗木類型在抗鹽能力方面有顯著差異，蔣建平[52]也在泡桐中發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗和扦插苗的耐鹽極限存在差異，前者耐鹽極限為0.2%～0.3%，后者耐鹽極限為0.25%，常越霞[53]以白蠟（Fraxinus chinensis）為材料，發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗的抗鹽性大于扦插苗，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)扦插苗的抗鹽性強(qiáng)于實(shí)生苗，這可能是因?yàn)椴牧仙L(zhǎng)狀態(tài)不同，石榴實(shí)生苗比較幼嫩更易發(fā)生鹽害的緣故。

通過(guò)研究鹽脅迫下石榴的生長(zhǎng)發(fā)育特性，發(fā)現(xiàn)石榴具有一定的抗鹽性，但高鹽濃度脅迫對(duì)石榴生長(zhǎng)造成了嚴(yán)重的危害，本試驗(yàn)也存在一些局限，如通風(fēng)狀況不夠良好，人工光照代替自然光等。下一步將在鹽濃度0～200 mol/L范圍內(nèi)，增加多個(gè)濃度梯度，找出鹽分濃度閾值，為石榴在鹽堿地區(qū)種植和栽培提供科學(xué)依據(jù)，且在自然條件下對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證，全面系統(tǒng)的研究石榴的耐鹽性。