新型陽離子核酸載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率研究

周思汝

摘要：目的：研究新型陽離子核酸載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。方法：運(yùn)用MTT比色法對DNA和LW13-2不同比例下的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析;在熒光顯微鏡下對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果：LW13-2細(xì)胞存活率會伴隨著DNA比例的增加而降低。DNA在轉(zhuǎn)染復(fù)合物中的含量較少，DNA和LW13-2質(zhì)量比為1：1、2：1、3：1，細(xì)胞存活率均在90%以上;當(dāng)DNA：LW13-2為1：3時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高能夠達(dá)到88.6%。轉(zhuǎn)染率下降，DNA：LW13-2為1：5～6，促使大量細(xì)胞破碎和死亡。結(jié)論：將新型的陽離子脂質(zhì)體核酸載體LW13-2應(yīng)用到體外核酸轉(zhuǎn)染中，展現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢，為后續(xù)的基因治療研究工作提供了載體系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞轉(zhuǎn)染;陽離子;核酸載體

【中圖分類號】 R254? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）17--01

陽離子核酸載體作為基因治療中一項(xiàng)新型的治療技術(shù)，通過將適宜的載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，有助于確?；虻某掷m(xù)性和穩(wěn)定性。核酸傳遞載體自身具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值，其在實(shí)際的使用過程中，展現(xiàn)出了較強(qiáng)的治療效果及治療質(zhì)量，是一種關(guān)鍵性的治療因素，通過與各種材料及基團(tuán)有機(jī)的組合在一起，形成一種新型的核酸載體，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，成為醫(yī)學(xué)行業(yè)的熱點(diǎn)研究問題。

1資料及方法

1.1一般材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

新型核酸載體材料LW13-2作為本次實(shí)驗(yàn)的主體材料，該材料在實(shí)驗(yàn)中保存，在大腸桿菌DH5中擴(kuò)增，QIAgene質(zhì)粒主要是從試劑盒中提取出來，在0.22μm微孔來完成除菌，放在-20℃下進(jìn)行保存。所有的細(xì)胞均使用10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺。

1.2方法

1.2.1LW13-2細(xì)胞毒性測定

運(yùn)用LW13-2對細(xì)胞的毒性進(jìn)行測定，運(yùn)用MTT比色法來進(jìn)行測定，將HEK293細(xì)胞種入到96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，其中含有100μL10%的FBSDMEM，5%的CO2，培養(yǎng)的時(shí)間控制在24h，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。LW13-2和Li-po2000各100μL，將以上兩種物質(zhì)溶解在PBS中，并將配成不同比例的轉(zhuǎn)染試劑加入到各細(xì)胞孔中，取4個(gè)復(fù)孔的平均值。在對照孔中培育PBS溶液，培養(yǎng)的時(shí)間控制在24h。將5mg/mL的MTT溶液50μL加入到孔中，在37℃下培養(yǎng)4h，確保MTT能夠還原為甲瓉，將培養(yǎng)板中的所有液體輕輕棄去，可見在細(xì)胞內(nèi)形成甲瓉結(jié)晶。為了使甲瓉結(jié)晶能夠快速溶解，需要將150μL二甲基亞砜DMSO加入進(jìn)去，振蕩10min。使用酶標(biāo)儀來測定波長吸光值，對細(xì)胞的存活率進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算方法為：細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度）100%。對計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析可知，細(xì)胞存活率與細(xì)胞的毒性呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞的存活率≥90%時(shí)，則可判定為低細(xì)胞毒性[1]。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作及轉(zhuǎn)染效率測定

取6只EP管，分別加入到EGFP質(zhì)粒DNA5μ中，按照陽離子轉(zhuǎn)染試劑方法加入，依次加入LW13-2和轉(zhuǎn)染復(fù)合物懸液，將液體放置在溫室中5min，之后將事先準(zhǔn)備好的96孔細(xì)胞加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，完成轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，之后對5%CO2放置在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3血清對基因轉(zhuǎn)染效率的影響

細(xì)胞準(zhǔn)備工作如前，按照3：1的質(zhì)量比來準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，分別加入5%、10%的復(fù)合物溶液及無血清DMEM，對液體進(jìn)行輕輕混勻，將其放置在溫室內(nèi)，時(shí)間到達(dá)5min后，再將其加至到細(xì)胞上。

1.2.4培養(yǎng)時(shí)間對基因轉(zhuǎn)染效率的影響

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的質(zhì)量比控制在3：1，細(xì)胞準(zhǔn)備工作如前所示，待作用4h后，棄轉(zhuǎn)染液，將含有10%的FBS加入到DMEM中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8、12、24和48h時(shí)，對細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀察，并計(jì)算出與GFP熒光細(xì)胞的比例。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性測定

在細(xì)胞液中加入不同濃度的轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間控制在24h。測定結(jié)果顯示，LW13-2細(xì)胞存活率會伴隨著DNA比例的增加而降低。DNA在轉(zhuǎn)染復(fù)合物中的含量較少，DNA和LW13-2質(zhì)量比為1：1、2：1、3：1，細(xì)胞存活率均在90%以上。將0.8μgDNA和2μLLipo2000，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，作用的時(shí)間控制在24h后，可知細(xì)胞的存活率在96.3%以上，與LW13-2的轉(zhuǎn)染復(fù)合物質(zhì)量相比，兩者之間的細(xì)胞毒性水平較為接近，不會對細(xì)胞活力造成較大的影響。

2.2不同因素對LW13-2基因轉(zhuǎn)染效率的影響

通過顯微鏡進(jìn)行觀察，對不同比例的質(zhì)粒及新型核酸載體混合物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在48h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，說明這一新型的核酸載體自身具有良好的轉(zhuǎn)染活性。并且熒光的強(qiáng)度也會隨著LW13-2含量的增加而增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染率最高能夠達(dá)到88.6%，當(dāng)DNA：LW13-2為1：3時(shí)所表現(xiàn)出來的。轉(zhuǎn)染率下降，DNA：LW13-2為1：5～6，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染率急劇下降，促使大量細(xì)胞破碎和死亡。

3討論

在本次實(shí)驗(yàn)中，通過對新型的陽離子脂質(zhì)體核酸載體LW13-2進(jìn)行合成，完成了對陽離子的改造和選擇，增加了核酸載體細(xì)胞的靶向性，確保了基因治療工作的發(fā)展。對轉(zhuǎn)染效果的影響因素進(jìn)行分析，可知質(zhì)粒DNA和陽離子脂質(zhì)體時(shí)重要因素，通過將兩者混合，促進(jìn)了脂質(zhì)體的形成，核酸物質(zhì)形成于囊泡結(jié)構(gòu)中，避免核酸酶發(fā)生降解。在不含血清的情況下，轉(zhuǎn)染效果最好，說明LW13-2在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中取得了較好的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000作為一種陽離子脂質(zhì)體，被廣泛應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)染中，在本次實(shí)驗(yàn)中，主要采用對比試劑研究的方式，對新型的陽離子脂質(zhì)體核酸載體轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LW13-2與Lipo2000具有相同的細(xì)胞毒性，細(xì)胞的整體存活率均在90%以上，DNA的轉(zhuǎn)染率高于Lipo2000，兩者之間差異性顯著。將新型的陽離子脂質(zhì)體核酸載體LW13-2應(yīng)用到體外核酸轉(zhuǎn)染中，展現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢，為后續(xù)的基因治療研究工作提供了載體系統(tǒng)[2]。

參考文獻(xiàn)：

[1]尹亞軍，李蕊清，劉歡，田蕾銘，張力瑞，張輝，路宏朝，張濤.高分子聚合物對兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的研究[J].陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，32（01）：64-69.

[2]王偲穎，林靖，韓媛媛，張華，黃盛文.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)肽核酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的研究[J].貴州醫(yī)藥，2016，40（04）：341-343.